復(fù)榮通脈膠囊對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜白細胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α水平的影響

王立新　王元松　田風(fēng)勝　邊　云　崔榮崗　賈彩霞　王慶凱

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復(fù)榮通脈膠囊對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜白細胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α水平的影響

王立新王元松田風(fēng)勝*邊云崔榮崗賈彩霞王慶凱

目的：觀察復(fù)榮通脈膠囊對糖尿病(DM)大鼠視網(wǎng)膜白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響。方法：60只Wistar大鼠隨機留取10只作為正常對照組；另外50只經(jīng)一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)制備DM模型；40只成模大鼠隨機分為DM模型組、復(fù)榮通脈低劑量組、復(fù)榮通脈中劑量組、復(fù)榮通脈高劑量組，每組10只。復(fù)榮通脈低、中、高劑量組分別給予0.7g、1.4g、2.8g/kg體重復(fù)榮通脈膠囊灌胃，其余兩組給予等量純凈水灌胃，每日1次，連續(xù)8周。腹主動脈采血測定各組大鼠血糖(BG)及總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，之后處死大鼠，摘取視網(wǎng)膜行組織病理切片及SP法免疫組化染色，觀察各組IL-1β及TNF-α的水平。結(jié)果：與正常對照組比較，DM模型組BG明顯升高(P<0.01)，復(fù)榮通脈各劑量組BG、TC、TG水平與DM模型組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，DM模型組IL-1β和TNF-α水平較正常對照組明顯增加(P<0.05)，復(fù)榮通脈低劑量組IL-1β和TNF-α水平明顯低于DM模型組(P<0.05)，復(fù)榮通脈中、高劑量組較低劑量組明顯降低(P<0.05)，復(fù)榮通脈中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：復(fù)榮通脈膠囊可能通過降低炎性因子水平發(fā)揮抗炎和保護視網(wǎng)膜作用。

復(fù)榮通脈膠囊；糖尿??；視網(wǎng)膜；白細胞介素-1β；腫瘤壞死因子-α；大鼠

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)常見慢性并發(fā)癥之一，是DM患者失明的主要原因。尋找更有效治療DR的藥物(包括中成藥)成為臨床重要課題。我們前期采用復(fù)榮通脈膠囊治療并發(fā)大血管病變及周圍神經(jīng)病變DM患者及DM動物均有很好療效，同時在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，復(fù)榮通脈膠囊對DR也具有一定的治療作用。因此，本文通過復(fù)制DM大鼠模型，觀察復(fù)榮通脈膠囊對其血糖(BG)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和其視網(wǎng)膜炎性指標白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的影響，初步探討復(fù)榮通脈膠囊對DR的治療作用及機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要藥物、試劑和儀器

1.1.1動物:清潔級健康成年雄性Wistar大鼠(體重 200±30g)60 只，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[合格證號：1405034，許可證號：SCXK(冀)2013-1-003]。

1.1.2主要藥物和試劑:復(fù)榮通脈膠囊主要由水蛭、地龍、全蝎、黃芪、當(dāng)歸、玄參、葛根、穿山龍、首烏藤、川牛膝、甘草等組成，由本院中藥制劑室監(jiān)制生產(chǎn)(批準文號：冀藥制字Z20070041，生產(chǎn)批號：140310)，每粒0.5g，含生藥2g，實驗時加入蒸餾水制成混懸液灌胃。鏈脲佐菌素(STZ)粉劑和檸檬酸鈉溶液購自美國Sigma公司(貨號：STZ S0130)；IL-1β及TNF-α免疫組化檢測試劑由石家莊市淼森科技有限公司提供(批號：IL-1β Bs3506、TNF-α Bs1857)；TC、TG檢測試劑購自日本和光WAKO(批號：Ep334、Ep332)。

1.1.3主要儀器:德國羅氏血糖儀(羅康全活力型)；日本日立7600-010型全自動生化分析儀；日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11型光學(xué)顯微鏡及照相裝置；病理組織漂烘處理儀(常州郝思琳,TEC2500)；江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型恒溫水浴箱；美國Media Cybernetics 公司多功能真彩色細胞圖像分析系統(tǒng)。

1.2實驗方法

1.2.1DM模型的建立：實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照完全隨機原則進行分組，正常對照組10只，造模組50只。造模組大鼠禁食12h后按文獻[1，2]方法略作改進，一次性腹腔注射STZ 60mg/kg(臨用前取STZ粉劑溶于0.1mmol/L、pH=4.2無菌檸檬酸鈉溶液中)；正常對照組腹腔注射等量檸檬酸鈉溶液。72h后尾靜脈取血測BG，其測值≥16.7mmol/L為DM大鼠造模成功[2]。本次造模有3只大鼠GB未達診斷標準，3只死亡，最后成模44只。1周后進入實驗。

1.2.2分組與給藥：44只成模大鼠按隨機數(shù)字表法抽取40只分為DM模型組及復(fù)榮通脈低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只。另4只用作其它實驗。參考文獻[3]方法，按人體-大鼠體表面積比值表換算實驗大鼠應(yīng)用復(fù)榮通脈膠囊等效劑量，即低劑量組0.7g/kg體重、中劑量組1.4g/kg體重、高劑量組2.8g/kg體重，每天新鮮配制復(fù)榮通脈溶液，每天灌胃一次，灌胃容量10ml/kg，連續(xù)8周。DM模型組和正常對照組每日以同等劑量純凈水灌胃。實驗期間大鼠自由進食、飲水，喂標準大鼠飼料，每天更換墊料，清理實驗室。實驗期間均未使用胰島素和其它降糖藥物。

1.2.3BG和血脂測定：連續(xù)灌胃8周后，各組大鼠隔夜禁食12h后稱重，以3%戊巴比妥鈉溶液(80mg/kg)腹腔注射麻醉，取尾尖血測BG后，迅速開腹分離腹主動脈，從腹主動脈采血，分離血清，按常規(guī)方法檢測TC和TG濃度。

1.2.4視網(wǎng)膜炎性因子測定：關(guān)腹后，迅速摘取各組大鼠一側(cè)眼球，于4%多聚甲醛溶液中固定48h以上，流水輕輕沖洗5min，于睫狀體后部經(jīng)鋸齒緣環(huán)形剪開鞏膜，去除眼前部分，將后眼杯以視乳頭為中心桔瓣樣切成3塊，輕輕分離視網(wǎng)膜，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)漂洗10min，甘氨酸緩沖液(0.15mol/L pH7.4)隔夜浸泡；再用3%胰蛋白酶37℃水浴孵化箱孵化2h后移入蒸餾水中震蕩漂洗至僅剩一層透明視網(wǎng)膜血管網(wǎng)；將其平鋪于載玻片上，置于37℃展片器5min,再置室溫自然干燥。嚴格按照IL-1β及TNF-α說明書進行免疫組化SP染色。結(jié)果判斷：顯微鏡下視細胞胞漿或胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性，采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)計算視網(wǎng)膜組織中IL-1β及TNF-α陽性染色面積與視窗面積的百分比進行定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠存活情況

實驗過程中DM模型組大鼠死亡1只(可能因注射STZ繼發(fā)性腹部感染死亡)，復(fù)榮通脈中劑量組死亡1只(可能因酮癥酸中毒或高滲綜合征死亡)，復(fù)榮通脈高劑量組逃逸1只，其它組未出現(xiàn)死亡和逃逸。37只DM大鼠BG水平明顯高于正常對照組(28.38±1.60mmol/L vs 4.86±0.20mmol/L，P<0.01)。

2.2各組大鼠BG、TC、TG水平比較

治療8周后，各組大鼠BG、TC、TG水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為58.32、12.01和24.13，均P<0.01)。DM模型組BG、TC、TG水平均明顯高于正常對照組(P<0.05或P<0.01)；復(fù)榮通脈低、中、高劑量組與DM模型組BG、TC、TG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　復(fù)榮通脈治療DM大鼠8周后血糖、血脂水平變化

注：與正常對照組比較,1)P<0.05，2)P<0.01

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜IL-1β及TNF-α表達

正常對照組視網(wǎng)膜視細胞外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊且平行，內(nèi)節(jié)橢圓體內(nèi)線粒體沿周邊排列，結(jié)構(gòu)正常; 外核層由視細胞胞體和胞核組成，細胞排列整齊，視細胞胞漿、胞核中可見極少量棕色IL-1β和TNF-α陽性顆粒。DM模型組及復(fù)榮通脈低劑量組視網(wǎng)膜視細胞外節(jié)膜盤間隙明顯擴大，結(jié)構(gòu)模糊不清，斷裂、溶解，可見空泡，外核層細胞核固縮; 內(nèi)節(jié)橢圓體內(nèi)線粒體水腫，排列不規(guī)則，視網(wǎng)膜視細胞胞漿、胞核中棕色IL-1β及TNF-α陽性面積較大。復(fù)榮通脈低劑量組棕色顆粒面積及強度低于DM模型組；復(fù)榮通脈中、高劑量組視網(wǎng)膜病變較復(fù)榮通脈低劑量組明顯改善，視網(wǎng)膜視細胞胞漿、胞核中棕色顆粒面積及強度更低于DM模型組及復(fù)榮通脈低劑量組。見圖1和圖2。

定量分析顯示，各組大鼠治療8周后視網(wǎng)膜視細胞IL-1β及TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.00及10.08，P均<0.01)。與正常對照組比較，DM模型組IL-1β及TNF-α水平明顯增加(P<0.05)；與DM模型組比較，復(fù)榮通脈低、中、高劑量組IL-1β及TNF-α水平均降低(P<0.05)，復(fù)榮通脈中、高劑量組更低于復(fù)榮通脈低劑量組(P<0.05)，但中、高劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　復(fù)榮通脈治療DM大鼠8周后視細胞IL-1β及TNF-α水平

注：與正常對照組比較,1)P<0.05;與DM模型組比較，2)P<0.05;與復(fù)榮通脈低劑量組比較,3)P<0.05

[本文圖1、圖2見封2]

3　討　論

DR屬于DM性微血管病變，是DM慢性并發(fā)癥之一，若發(fā)現(xiàn)和治療不及時，最終可致盲，嚴重降低患者生活質(zhì)量。隨著T2DM患者逐年增多，DR的發(fā)病率也隨之上升。因而對 DR 的防治成為臨床至關(guān)重要的課題。有研究認為，炎癥及免疫反應(yīng)作用于 DR 始終[4]，炎癥反應(yīng)相關(guān)細胞因子IL-1β 和 TNF-α 可能參與了 DR的發(fā)生發(fā)展過程 。

IL-1β 不僅能夠調(diào)節(jié)細胞免疫，同時還作用于視網(wǎng)膜色素上皮細胞，促使其合成膠原，形成膠原沉積，參與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR) 的病理過程[5]；IL- 1β還能促使粒細胞透過血-視網(wǎng)膜屏障，進入視網(wǎng)膜，引起炎癥反應(yīng)[6]；IL-1β通過上調(diào)核因子-κB(NF-κB)水平，加速視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞凋亡[7]。TNF-α 具有激活單核巨噬細胞、成纖維細胞趨化作用，使視網(wǎng)膜間充質(zhì)細胞形成胞外基質(zhì)蛋白，為內(nèi)皮細胞的移行提供支撐，以及引起其它微血管并發(fā)癥。Gema等[8]在患者纖維組織血管壁、玻璃體和視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞基質(zhì)及胞外基質(zhì)中均發(fā)現(xiàn) TNF-α 表達增加；而TNF-α 拮抗劑可競爭性與其受體結(jié)合，阻斷 TNF-α 效應(yīng)，降低DM大鼠視網(wǎng)膜血管中的白細胞黏附作用；抑制 TNF-α 表達可使視網(wǎng)膜毛細血管周細胞、內(nèi)皮細胞凋亡減少76%-80%[9]。

復(fù)榮通脈膠囊為本院自制復(fù)方中成藥，以水蛭為君，地龍、全蝎為臣，佐以黃芪、當(dāng)歸、玄參、葛根、穿山龍、首烏藤，川牛膝及甘草為使。主要用于肢體麻涼、疼痛、感覺異常的血痹及DM周圍神經(jīng)和血管病變患者。其主要作用機制為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的破血通絡(luò)、益氣養(yǎng)陰、安神止痛；以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗凝、抗血小板聚集、抗氧化、抗炎等多種途徑。

本研究結(jié)果顯示，DM大鼠視網(wǎng)膜視細胞IL-1β及TNF-α水平明顯升高，表明炎癥參與了DR的發(fā)生發(fā)展。低、中、高劑量復(fù)榮通脈干預(yù)能夠明顯抑制炎性因子IL-1β及TNF-α的表達，從而具有減輕炎癥反應(yīng)、保護視網(wǎng)膜的功效，中、高劑量組療效更好。提示復(fù)榮通脈膠囊的作用可能有劑量依賴性，但非線性關(guān)系，因而從藥物經(jīng)濟學(xué)角度考慮，使用中等劑量復(fù)榮通脈膠囊較好。文中復(fù)榮通脈膠囊對DM大鼠BG、TC、TG無明顯影響的現(xiàn)象說明復(fù)榮通脈膠囊對DR的保護作用為非降糖、降脂依賴性。

綜上所述，1.4g/kg體重復(fù)榮通脈膠囊可能通過下調(diào)DM大鼠視網(wǎng)膜組織炎性因子IL-1β及TNF-α的表達，抑制炎癥，保護視網(wǎng)膜，該結(jié)果為臨床應(yīng)用該藥物治療DR提供了部分實驗依據(jù)。

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本文第一作者簡介：

王立新(1958-)，男，漢族，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病合并心臟病

1張 均.現(xiàn)代藥理實驗方法學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998：981.

2于德民，吳銳，尹濰，等.實驗性鏈脲佐菌素動物模型的研究[J].中國糖尿病雜志，1995，3(2)：105-109.

3徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005： 202-204.

4Abu El-Asrar Am，Desmet S，Meersschaert A，et al． Expression of the inducible isoform of nitric oxide synthase in the retinas of human subjects with diabetes mellitus[J]． Am J Ophthalmol，2001，132(4):551-556．

5馮學(xué)峰，惠延年，王雨生． IL-1β 對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞膠原合成的作用[J]． 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1999，20(8):656-658．

6Jung YD，Liu W，Reinmuth N，et al． Vascular endothelial growth factor is up regulated by interleukin21β in human vascular smooth muscle cells via the P38 mitogen-activated protein kinase pathway[J]． Angiogenesis，2001，4(2):155-162．

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9Joussen AM，Poulaki V，Mitsiades N，et al． Nonsteroidal anti inflammatory drugs prevent early diabetic retinopathy via TNF-α supp ression[J]． The FASEB Journal，2002，16(3):438-440．

10Behl Y，Krothapalli P，Desta T，et al． Diabetes enhanced tumor necrosis factor-α production promotes apop tosis and the loss of retinal microvascular cells in type 1 and type 2 models of diabetic retinopathy[J]． Am J Pathol，2008，172(8):1 411-1 418．

Influence of FuRongTongMai Capsules on Sciatic Nerve Expression of IL-1β and TNF-α in Diabetes Mellitus Rats

WANG Li-xin,WANG Yuan-song,TIAN Feng-sheng*,BIAN Yun,CUI Rong-gang,JIA Cai-xia,WANG Qing-kai

Department of Endocrinology,Affiliated CangZhou Traditional-western Conbination Medical Hospital of Hebei Medical University,Cangzhou 061001,China；*Corresponding author

Objective:To observe the the influence of FuRongTongMai capsules on retinal capillary expression of IL-1β and TNF-α in diabetes mellitus(DM) rats.Method:10 of 60 rats were randomly divided into normal control group.Another 50 by injection of 1% STZ.After diabetes mellitus(DM) rats were made,40 of diabetes rats were randomly divided into DM group,FuRongTongMai capsules low dosage group(FRL),FuRongTongMai capsules middle dosage group(FRM),FuRongTongMai capsules high dosage group(FRH),every group has 10 rats.FRM was given the 1.4 g/(kg body weight) to fill the stomach,FRL was given 0.7 g/(kg body weight) ,FRH was given 2.8 g/(kg body weight) ,the rest of the two groups of daily to give the same dose of Purified water one time a day,eight weeks in a row.Blood glucose and blood lipid [total cholesterol (TC),triglyceride (TG)] level,executed gather the retinal tissue of rats after pathological and immunohistochemical staining SP method,and the expression of TNF-a and IL-1β were detected.Results:Compared with normal control group,model group significantly increased blood sugar,FRL,FRM,FRH groups blood sugar,TC,TG levels were significant difference in the DM group (P>0.05).The expression of IL-1β and TNF-α in DM group were significantly increased than normal group(P<0.05),which were decreased in FRL group compared with DM group(P<0.05) and FRM;FRH lower than FRI group.FRM and FRH group had no statistical significance (P>0.05).Conclusion:FuRongTongMai capsules could play a role of improving the diabetic retinopathy by reducing the inflammatory factors.

FuRongTongMai capsules;Diabetes;Retinal capillary;IL-1β;TNF-α;Rat

單位]河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌三科，滄州 061001；*

,E-mail：cztianfsh@sina.com

本文2016-01-26收到，2016-05-03修回

R285.5[文獻標識碼]A

1005-1740(2016)03-0007-04