志賀菌實(shí)驗(yàn)室快速分子檢測與分析*

陜西省疾病預(yù)防控制中心(西安710054)

石　一　張　錚　張　義　馬國柱　劉長宏　陳　颯　劉　峰　劉東立▲

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志賀菌實(shí)驗(yàn)室快速分子檢測與分析*

陜西省疾病預(yù)防控制中心(西安710054)

石一張錚張義馬國柱劉長宏陳颯劉峰劉東立▲

目的：探討群體性感染性腹瀉的發(fā)生病因。方法：采用試劑盒和多重PCR的方法進(jìn)行快速檢測。結(jié)果：核酸結(jié)果顯示志賀菌陽性， ipaH毒力基因陽性。結(jié)論：此次感染是一起由志賀菌引起的痢疾暴發(fā)疫情，多重PCR方法相比傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的方法更加快捷。

主題詞腹瀉/病因?qū)W腹瀉/診斷志賀菌屬/診斷聚合酶鏈反應(yīng)@快速檢測

2015年10月中旬，陜西省彬縣某幼兒園多名兒童出現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、頭痛等癥狀，先后28例兒童入院，其中1例兒童癥狀較重入住小兒ICU，經(jīng)過現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測，懷疑此次疫情可能是由志賀菌引起的一起細(xì)菌性痢疾暴發(fā)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分析報(bào)告如下。

材料與方法

1標(biāo)本與試劑

1.1標(biāo)本來源：共收集標(biāo)本22份，其中病人標(biāo)本10份，環(huán)境標(biāo)本12份。

1.2試劑來源：Mac平板購自梅里埃生物制品有限公司，GN生化鑒定卡由法國梅里埃公司生產(chǎn)，核酸提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，韓國Seeplex腹瀉多重PCR試劑盒購自杭州紐羅西敏生物科技有限公司，DNA引物委托上海生工合成。

1.3 儀器：法國梅里埃公司VITEK2全自動(dòng)生化分析儀。

2方法

2.1常規(guī)培養(yǎng)：將所有標(biāo)本接種Mac平板，36℃培養(yǎng)24h，挑取可疑菌落，進(jìn)行生化試驗(yàn)。生化分析采用法國梅里埃公司VITEK2全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析。

2.2核酸提取：核酸提取使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取方法按照說明書進(jìn)行。

2.3Seeplex腹瀉多重PCR檢測：首先使用Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒對(duì)所提核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)方法參照說明書，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，電壓120V，電泳時(shí)間1h。

2.4志賀菌毒力基因檢測：委托上海生工合成志賀菌SET1、SET2、ial、ipaH毒力基因PCR引物，具體引物序列[1]見表1。PCR反應(yīng)采用25μl擴(kuò)增體系，模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×Taq MasterMix 12.5μl，ddH2O補(bǔ)至25μl。四種毒力基因PCR循環(huán)參數(shù)相同，95℃ 5min，95℃ 50s，56℃ 50s，72℃

表1　志賀菌4種毒力基因引物序列

60s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7min[1]。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測，電壓120V，電泳時(shí)間30min。

結(jié)　果

1現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果本次流行病學(xué)調(diào)查44例，其中男24例，女20例，男女比例為1.2∶1。發(fā)病年齡3～6歲，發(fā)病最多年齡的是5歲(61.36%)。病例多集中在二樓廁所周圍的3個(gè)班級(jí)，罹患率分別為17.54%、15.38%、24.56%，該樓層沒有流水洗手設(shè)施。首例病例的發(fā)病時(shí)間為12日上午8時(shí)，15日晚病例數(shù)迅速增加，16日8時(shí)至16時(shí)達(dá)發(fā)病高峰，17日病例數(shù)開始迅速減少，病例主要集中在16日。

2分離培養(yǎng)結(jié)果可疑菌落經(jīng)VITEK2生化鑒定均為大腸埃希菌，未分離到志賀菌。

3試劑盒檢測結(jié)果對(duì)部分病人和環(huán)境標(biāo)本采用Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒檢測結(jié)果顯示：4份病人標(biāo)本志賀菌核酸陽性，2份環(huán)境標(biāo)本志賀菌核酸陽性(包括1份便池標(biāo)本和1份洗手盆標(biāo)本)。見圖1～2。

圖1Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒PCR擴(kuò)增結(jié)果(1～9患者，10～13環(huán)境)

圖2Diarrhea-B1 ACE Detection試劑盒PCR擴(kuò)增結(jié)果(1～9環(huán)境)

4毒力基因檢測結(jié)果挑取部分病人和環(huán)境標(biāo)本進(jìn)行志賀菌毒力基因檢測，結(jié)果顯示：上述4份病人標(biāo)本均擴(kuò)增出志賀菌ipaH基因條帶，其中2例病人同時(shí)擴(kuò)增出SET1基因條帶，還有1例病人擴(kuò)增出混合條帶(15號(hào))。見圖3。

圖34種毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(1～4，15患者，5～14環(huán)境)

討　論

志賀菌為革蘭陰性桿菌，胞內(nèi)致病，具有高度的傳染性危害嚴(yán)重。據(jù)2011年中國重點(diǎn)傳染病和病媒生物監(jiān)測報(bào)告的統(tǒng)計(jì)，2011年全國共報(bào)告細(xì)菌性痢疾病例236321例，死亡23例，發(fā)病率17.62/10萬，病死率0.0096%。陜西省2011年報(bào)告的痢疾病例數(shù)為9559例，死亡1例，病死率0.01%，發(fā)病率高居法定甲、乙類傳染病報(bào)告前三名，嚴(yán)重的影響了人們的生產(chǎn)生活。該菌主要危害兒童，尤其是5歲以下的幼兒，病死率3%～ 5%。

志賀菌是由一個(gè)環(huán)狀染色體和環(huán)狀大質(zhì)粒組成的，其上含有的毒力基因決定了志賀菌的致病性[2]，ipaH 基因、SET 1 基因、SET 2 基因、ial 基因已經(jīng)確定與人類疾病相關(guān)。ipaH 基因一般被用來鑒定志賀菌。ial位于大質(zhì)粒上一般與侵襲性相關(guān)。SET 1和 SET 2是兩種常見的志賀氏菌腸毒素，SET 1熱穩(wěn)定，SET 2部分能與志賀腸毒素的抗血清發(fā)生中和。本次實(shí)驗(yàn)4例病人均擴(kuò)增出了ipaH基因條帶，與韓國Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒的結(jié)果一致，其中2例同時(shí)擴(kuò)增出SET1基因條帶，還有1例擴(kuò)增出SET1基因，但未擴(kuò)增出ipaH基因條帶。未擴(kuò)增出ipaH基因條帶的病人標(biāo)本有待我們進(jìn)一步的分析。而對(duì)于環(huán)境標(biāo)本，Seeplex腹瀉病多重PCR試劑盒檢測出兩份志賀氏菌核酸陽性，但毒力基因檢測并未擴(kuò)增出任何條帶，可能是由于引物設(shè)計(jì)的不同。

傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)的方法一直被認(rèn)為是確定病原菌的金標(biāo)準(zhǔn)。然而現(xiàn)在由于抗生素的大量使用，很多標(biāo)本很難分離培養(yǎng)出真正的病原菌。隨著 PCR技術(shù)的出現(xiàn)，尤其是熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)[3]，彌補(bǔ)了很多傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法上的不足，而且更加便捷。感染性腹瀉是突發(fā)公共衛(wèi)生事件中最常見的一種，如何快速確定病因至關(guān)重要，現(xiàn)在針對(duì)各種病原菌的商用PCR檢測試劑盒，熒光定量PCR檢測試劑盒非常多，檢測的毒力基因各不相同，靈敏度差異也很大，如何既能提高我們的檢測效率，又能準(zhǔn)確確定病因，是我們亟待思考的問題。

[1]胡守奎，胡萬富，王敏，等. 安徽省2008-2010年宋內(nèi)氏志賀菌分子流行病學(xué)分析[J].中華疾病控制雜志，2013，17(11)：959-962.

[2]冉丹丹，于學(xué)輝，宋定州，等.志賀菌毒力相關(guān)因子研究現(xiàn)狀[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2012，38(3)：390-395.

[3]Xia S，Xu B，Huang L，etal. Prevalence and characterization of human shigella infections in Henan province，China，in 2006[J].Clin Microbiol，2011，49(1) : 232-242．

(收稿：2016-06-10)

Rapid detection and analysis in an outbreak of infectious diarrhea caused by Shigella spp

Shaanxi Province Center for Disease Control and Prevention(Xi’an 710054)

Shi YiZhang ZhengZhang Yi et al

Objective: To analysis the cause of an outbreak of infectious diarrhea in Binxian County, Xianyang.Methods: Cultured according to the GB4789.5-2012, meanwhile Seeplex kit and the method of multiplex PCR was used for rapid detection.Results: Nucleic acid showed Shigella virulence gene positive ipaH positive.Conclusion: The outbreak was caused by Shigella spp.Seeplex and the multiplex PCR method compared with the traditional bacterial cultured method are more efficient.

Diarrhea/etiologyDiarrhea/diagnosisShigella/diagnosisPolymerase chainreaction@Rapid detection

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.075

*陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)衛(wèi)生科研項(xiàng)目(D11)