腦血通片質量標準研究

童志遠，古　雪，顏曉燕，陳　燕，代　晶△

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥劑科(成都　610513)；2.成都醫(yī)學院 藥學院(成都　610083)

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腦血通片質量標準研究

童志遠1，古雪2，顏曉燕2，陳燕2，代晶2△

1.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 藥劑科(成都610513)；2.成都醫(yī)學院 藥學院(成都610083)

目的建立腦血通片的含量測定方法，完善其質量標準。方法采用紫外可見分光光度法建立腦血通片中總黃酮、總氨基酸含量測定方法。結果蘆丁、谷氨酸分別在10.02～60.12 μg·mL-1(r=0.9 999)、 2.009～10.044 μg·mL-1(r=0.9 990)范圍內線性關系良好，平均加樣回收率分別為101.86%(RSD=2.20%)、101.32%(RSD=2.37%)，3批制劑中總黃酮、總氨基酸含量分別為66.73、29.44 mg·g-1。結論本研究建立的方法簡單，結果準確，重現(xiàn)性好，可用于腦血通片的質量控制。

腦血通片；紫外可見分光光度法；總黃酮；總氨基酸

腦血通片是成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院的自制制劑，主要由丹參、當歸、紅花、川芎、蜈蚣等12味藥材組成，具有活血化瘀，通絡止痛功效，主要用于腦動脈硬化、腦血管痙攣所致頭痛，其臨床應用效果顯著，無明顯不良反應，患者反饋較好。但由于其成分復雜，所含藥材較多，且同時含有植物藥和動物藥，目前尚未建立有效的質量控制標準。為有效控制腦血通片的質量，保證用藥安全有效，實驗組前期主要以藥典為參考資料[1-2]，選取了需粉碎入藥的白芷、丹參、蜈蚣、蝎子進行顯微鑒別；采用TLC法對制劑中的丹參、川芎、當歸進行了定性鑒別。同時，也嘗試使用HPLC法建立腦血通片的含量測定方法，但在實驗中發(fā)現(xiàn)由于本制劑成分復雜，雜質干擾較大，難以對單一成分進行分離，且含量較低難以定量。根據(jù)查閱的資料[1]顯示，處方中丹參、當歸、紅花、蔓荊子等多味藥材中含有大量的黃酮類成分，而處方中含有的多味動物藥(如蜈蚣、全蝎等)及丹參、當歸等也富含氨基酸。研究[3-14]報道，通過紫外可見分光光度法測定中藥材或中成藥中總黃酮、總氨基酸成分的方法已較為成熟。分光光度法測黃酮、氨基酸含量常用直接測定法和顯色測定法。直接測定法[8]依據(jù)黃酮、氨基酸自身結構特點，不使用顯色劑，直接在其特征吸收峰處對供試樣進行測定。該方法對單一成分的樣品測定簡便、快速、準確；但對成分復雜的中藥復方制劑而言，雜質的干擾大，誤差較大。一般認為顯色測定法明顯優(yōu)于直接法測定的結果，且多糖、皂苷對實驗均無干擾。通過文獻研究，在前期實驗的基礎上，本研究擬定以總黃酮和總氨基酸作為指標性成分，采用紫外可見分光光度法中的顯色測定法作為含量測定方法，旨在為腦血通片質量標準的建立提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1試藥

腦血通片(批號：20150116,20130723,20110524，成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科)；蘆丁對照品(批號：MUST-15091104，純度98.00%，購自成都曼斯特生物科技有限公司)；谷氨酸對照品(批號：140690-200802，純度100.00%，中國藥品生物制品檢定所)；亞硝酸鈉(批號：20150611，天津博迪化工股份有限公司)；硝酸鋁·9H2O(批號：2015012801，成都市科龍化工試劑廠)；氫氧化鈉、茚三酮(批號：20151110，20150529，天津市瑞金特化學品有限公司)；無水醋酸鈉、冰乙酸(批號：2015121044，2015102031，天津致遠化學試劑有限公司)；試劑均為分析純，水均為純化水。

1.2儀器

紫外可見分光光度計(型號：BlueStar A，北京萊博泰科儀器股份有限公司)；Thermo微量臺式離心機(型號：Heraeus Pico 17，美國賽默飛世爾科技公司)；調溫電熱套(型號：ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；電子分析天平(型號：BP211D，賽多利斯科學儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(型號：HH-S4型，北京科偉永興儀器有限公司)；pH計(型號：pHS-3C，成都世紀方舟科技有限公司)。

2　方法與結果

2.1總黃酮的含量測定方法建立[3-8]

2.1.1溶液配制1)蘆丁對照品溶液的制備：精密稱定蘆丁對照品10.02 mg，置于10 mL容量瓶中，用適量80%的乙醇[3]溶解后，定容，搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取該對照品儲備液5.0 mL于25 mL容量瓶中，用80%的乙醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 004 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。2)總黃酮樣品溶液的制備：取腦血通片20片，研磨成粉，精密稱取片粉0.2 g，置于圓底燒瓶中，加入200倍量的60%乙醇，加熱回流，沸騰后提取30 min， 冷卻至室溫，用60%的乙醇補足減失的重量，搖勻，離心(10 000 r，5 min)，濾過(0.45 μm)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2檢測波長的選擇精密吸取蘆丁對照品溶液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用80%乙醇補足3 mL后，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min， 加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min， 再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，加80%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后，以相應試劑為空白，在400～600 nm的波長范圍內進行掃描，結果顯示蘆丁在508 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為508 nm。

2.1.3總黃酮樣品溶液的制備條件篩選1)提取溶劑考察：精密稱定腦血通片粉0.5 g，共8份，分別置于圓底燒瓶中，各加200倍量的水、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流，沸騰后提取30 min，冷卻至室溫，用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，離心(10 000 r，5 min)，濾過(0.45 μm)，取續(xù)濾液，得各供試品溶液。分別精密吸取1.0 mL于10 mL容量瓶中，按2.1.2項下方法顯色后，以樣品本底為空白，在508 nm處測定吸光度。計算得總黃酮相對百分含量分別為91.14%、93.01%、95.67%、100.49%、100.00%、99.58%、95.79%、81.89%，結果表明，乙醇濃度為50%～70%時，提取量最大，故選擇60%乙醇為提取溶劑。2)料液比考察：精密稱定腦血通片粉0.5 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，以60%乙醇為溶劑，料液比分別為1∶100、 1∶150、1∶200、1∶250、1∶300，其余操作同2.1.3 1)項下方法。計算得總黃酮含量分別為59.03、60.43、60.44、60.46、61.49 mg·g-1，結果表明，料液比對提取量影響較小，故為方便后續(xù)實驗，選擇料液比為1∶200。3)提取時間考察：精密稱定腦血通片粉0.5 g，共6份，分別置于圓底燒瓶中，以60%乙醇為溶劑，料液比為1∶200，提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min(沸騰時開始計時)，其余操作同2.1.3 1)項下方法。計算得總黃酮相對百分含量分別為96.06%、98.48%、100.00%、100.16%、100.16%、100.47%，結果表明,30 min后提取量趨于穩(wěn)定，故選擇提取時間為30 min。4)提取溫度考察：精密稱定腦血通片粉0.5 g，共6份，分別置于圓底燒瓶中，以60%乙醇為溶劑，料液比為1∶200，提取時間為30 min(沸騰時開始計時)，提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，80 ℃、沸騰溫度，其余操作同2.1.3 1)項下方法。計算得總黃酮含量分別為59.30、59.68、60.65、61.36、62.63、63.88 mg·g-1，結果表明,隨著提取溫度的升高，提取量逐漸增加，故選擇沸騰溫度為提取溫度。

2.1.4標準曲線的制備精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，按2.1.2項下方法顯色后，得對照品系列標準溶液，以第一份為空白，在508 nm處測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標(X)，吸光度A為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：Y=12.769X-0.0 044(r=0.9 999)， 表明蘆丁在10.02～60.12 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.5加樣回收試驗精密稱定已知含量(65.84 mg·g-1)的片粉0.05 g 6份，分別加入3.2 960 mg蘆丁對照品，按2.1.1 2)項下方法制備各供試品溶液。分別取1.0 mL按2.1.2項下方法操作顯色后，在508 nm處測定吸光度并計算回收率。平均回收率為101.86%，RSD為2.20%，表明該含量測定方法加樣回收率良好。

2.2總氨基酸含量測定方法的建立[9-14]

2.2.1溶液配制提取1)2%茚三酮溶液的配制：精密稱取茚三酮2 g，置于100 mL棕色量瓶中，加乙醇適量溶解后，定容至刻度，搖勻，避光保存。2)谷氨酸對照品溶液的制備：精密稱定谷氨酸對照品25.11 mg，置于25 mL容量瓶中，用適量水溶解后，定容，搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取該對照品儲備液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 004 mg·mL-1的谷氨酸對照品溶液。3)總氨基酸樣品溶液的制備：取腦血通片20片，研磨成粉，精密稱取片粉0.2 g，置于圓底燒瓶中，加入200倍量的水，60 ℃水浴加熱回流提取30 min，冷卻至室溫，并用水補足減失的重量，搖勻，離心(12 000 r， 5 min)，濾過(0.45 μm)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2檢測波長的選擇精密吸取谷氨酸對照品溶液1.5 mL，置于25 mL容量瓶中，用水補足5 mL后，加入醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 6.0)1.0 mL，搖勻，加入2%茚三酮溶液1.0 mL，搖勻，沸水浴15 min， 待冷卻至室溫，用水定容至刻度，搖勻。以相應試劑為空白，在500～700 nm的波長范圍內進行掃描，結果顯示谷氨酸在570 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為570 nm。

2.2.3總氨基酸樣品溶液制備條件篩選1)提取溶劑考察：精密稱定腦血通片粉0.2 g，共6份，分別置于圓底燒瓶中，分別加200倍量的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇，加熱回流，沸騰后提取30 min，冷卻至室溫，并用提取溶劑補足減失的重量，搖勻，離心(12 000 r，5 min)，濾過(0.45 μm)，取續(xù)濾液，得各供試品溶液。分別精密吸取1.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.4.2項下方法顯色后，以沸水浴前溶液為空白，在570 nm處測定吸光度。計算得總氨基酸含量分別為30.15、30.07、27.83、25.45、18.78、7.75 mg·g-1，結果表明，乙醇濃度越大，提取量越小，水為提取溶劑時，提取量最大，故選擇水為提取溶劑。 2)料液比考察：精密稱定腦血通片粉0.2 g，共5份，分別置于圓底燒瓶中，以水為溶劑，料液比分別為1∶100、1∶150、1∶200、 1∶250、1∶300，其余操作同2.2.3 1)項下方法。計算得總氨基酸含量分別為25.00、26.93、29.69、29.87、29.51 mg·g-1，結果表明，當料液比增至1∶200后，提取量逐漸趨于穩(wěn)定，故為方便后續(xù)實驗，選擇料液比為1∶200。3)提取時間考察：精密稱定腦血通片粉0.2 g，共6份，分別置于圓底燒瓶中，以水為溶劑，料液比為1∶200，提取時間分別為10、20、30、40、50、60 min(沸騰時開始計時)，其余操作同2.2.3 1)項下方法。計算得總氨基酸含量分別為23.00、27.76、30.42、30.08、29.16、27.66 mg·g-1，結果表明, 30 min后提取量開始下降，故選擇提取時間為30 min。4)提取溫度考察：精密稱定腦血通片粉0.2 g，共7份，分別置于圓底燒瓶中，以水為溶劑，料液比為1∶200，提取時間為30 min，提取溫度分別為40、50、60、70、80、90、100 ℃，其余操作同2.2.3 1)項下方法。計算得總氨基酸含量分別為28.85、30.73、32.58、32.43、31.83、30.06、29.51 mg·g-1， 結果表明,60～80 ℃提取量較高，故選擇60 ℃為提取溫度。

2.2.4標準曲線的制備精密吸取谷氨酸對照品溶液0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，按2.2.2項下方法顯色后，得對照品系列標準溶液，以相應試劑為空白，在570 nm處測定吸光度。以對照品濃度為橫坐標(X)，吸光度A為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.08 871X-0.08 557(r=0.9 990)。表明谷氨酸在2.009～10.044 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.5加樣回收試驗精密稱定已知含量32.35 mg·g-1的片粉0.1 g 6份，分別加入3.2 141 mg谷氨酸對照品，按2.2.1 3)項下方法制備各供試品溶液。分別取1.0 mL按2.2.2項下方法操作顯色后，在570 nm處測定吸光度，計算回收率。平均回收率為101.32%，RSD為2.37%，表明該含量測定方法加樣回收率良好。

2.3樣品測定

取3批樣品，分別按上述方法測定總黃酮和總氨基酸含量，每批平行測定3次，3批制劑總黃酮、總氨基酸平均含量分別為66.73、29.44 mg·g-1(表1)。

表1　樣品測定結果

3　討論

中成藥質量標準研究的含量測定方法[15-16]包括：分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。目前最常用的是高效液相色譜法，前期實驗發(fā)現(xiàn)，本制劑成分復雜，難以對單一成分進行分離，且含量較低難以定量。根據(jù)資料[1]顯示，處方中丹參、當歸、紅花、蔓荊子等多味藥材中含有大量的黃酮類成分，多味動物藥(如蜈蚣、全蝎等)及丹參、當歸等富含氨基酸，同時據(jù)文獻報道，通過UV-VIS法測定中藥材或中成藥中總黃酮、總氨基酸的方法已較為成熟。分光光度法測黃酮、氨基酸常用的有直接測定法和顯色測定法，直接測定法不使用顯色劑,依據(jù)黃酮、氨基酸自身結構的特點,直接在其特征吸收峰處對供試樣進行測定[8]。該方法對單一成分的樣品測定簡便、快速、準確；但對成分復雜的中藥復方制劑來說，雜質的干擾大，易出現(xiàn)誤差。一般認為顯色法優(yōu)于直接法測定的結果，且多糖、皂苷對實驗均無干擾[8]。因此在前期實驗的基礎上，本試驗擬定以總黃酮和總氨基酸作為指標性成分，采用UV法中的顯色測定法作為含量測定的研究方法。經(jīng)方法學考察證明，該方法可用于腦血通片的日常檢驗和質量控制。

綜上所述，總黃酮和總氨基酸的含量測定結果表明，不同批次的腦血通片中總黃酮和總氨基酸的含量有所差異，這是由于腦血通片為中藥制劑，其質量受中藥材產(chǎn)地、采集季節(jié)[7-9]等多種復雜因素的影響，藥材質量參差不齊，導致了樣品間的質量差異。因此未來的研究還需對更大批量的制劑進行含量測定，確定其總黃酮、總氨基酸含量的限度。

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Study on the Quality Standard of Naoxuetong Tablets

TongZhiyuan1,GuXue2,YanXiaoyan2,ChenYan2,DaiJin2△.

1.TheFirstAffiliatedHospital,ChengduMedicalCollege,Chengdu610513,China; 2.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

ObjectiveTo establish a method for the content determination of Naoxuetong Tablets and improve its quality standard. MethodsUV-Visible spectrophotometry was adopted to establish the method to assay the content of total flavonoids and total amino acid in Naoxuetong Tablets. ResultsThe contents of rutin and glutamic acid showed a good linear relationship in the range of 10.02μg·mL-1～60.12μg·mL-1(r=0.9 999) and 2.009μg·mL-1～10.044μg·mL-1(r=0.9 990) respectively, and the average recoveries were 101.86% (RSD=2.20%) and 101.32% (RSD=2.37%) respectively. The average contents of total flavonoids and total amino acid of three batches of Naoxuetong Tablets were 66.73 mg·g-1and 29.44 mg·g-1respectively. ConclusionThe established method is simple, accurate and reproducible, so it can be adopted to control the quality of Naoxuetong Tablets.

Naoxuetong Tablets; UV-visible spectrophotometry; Total flavonoids; Total amino acid

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.019

R283.6

A

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.1740.012.html