腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體在B淋巴瘤細胞株中的敏感性及誘導細胞凋亡機制*

卿曉玲，陳自敏，陳　瑜，王　洪，李　艷，余　赟，余小鳳，尹春莉，姚雙群，田茂岑，楊　平，李敏惠

1.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都　610083)；2.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都　610083)；3.成都醫(yī)學院 科研實驗中心(成都　610083)

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腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體在B淋巴瘤細胞株中的敏感性及誘導細胞凋亡機制*

卿曉玲1，陳自敏1，陳瑜1，王洪1，李艷1，余赟2，余小鳳1，尹春莉1，姚雙群1，田茂岑1，楊平2，李敏惠3△

1.成都醫(yī)學院 生物醫(yī)學系(成都610083)；2.成都醫(yī)學院 基礎醫(yī)學院(成都610083)；3.成都醫(yī)學院 科研實驗中心(成都610083)

目的探討腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TRAIL)在B淋巴瘤細胞株中的敏感性及TRAIL通過線粒體信號通路誘導人B淋巴瘤細胞株Ramos凋亡的機制。方法采用CCK-8法檢測腫瘤細胞增殖，流式細胞術(shù)分析細胞線粒體膜電位、細胞表面受體DR4/DR5表達及細胞凋亡率變化，并用Western Blot測定Ramos細胞經(jīng)TRAIL作用24 h后相關(guān)凋亡蛋白的表達水平。結(jié)果供試的4株B淋巴瘤細胞中，Ramos細胞為TRAIL敏感株，Ramos細胞表面受體DR4/DR5表達水平明顯高于TRAIL耐藥株；TRAIL抑制Ramos細胞增殖通過誘導細胞凋亡介導；細胞調(diào)亡伴隨線粒體膜電位明顯變化；Western Blot免疫印跡結(jié)果顯示，藥物作用后，細胞內(nèi)相關(guān)凋亡信號分子包括Caspase-9，Caspase-3，PARP蛋白等均明顯活化。結(jié)論4株B淋巴瘤細胞株對TRAIL敏感性不同，并與DR4/DR5表達相關(guān)；TRAIL抑制Ramos細胞增殖，誘導細胞凋亡，引起線粒體膜電位明顯下降，活化Caspase-9及下游凋亡蛋白；線粒體調(diào)亡途徑是介導TRAIL誘導Ramos細胞凋亡的途徑之一。

TRAIL；B淋巴瘤；細胞凋亡；線粒體途徑

腫瘤是嚴重危害人類生命和健康的疾病之一，臨床上采取的治療方法包括手術(shù)、化療、放療、生物治療、中醫(yī)藥治療等。治療過程中，患者體內(nèi)毒副作用的產(chǎn)生，使得其療效往往不盡如人意。目前，應用的抗腫瘤藥物對約70%的患者療效有限，甚至20%～40%的患者可能接受了錯誤的藥物治療。因此，對于腫瘤患者來說，最大限度降低腫瘤治療過程中毒副作用的“個體化醫(yī)療”意義重大。個體化醫(yī)療己成為惡性腫瘤、高血壓、糖尿病等重大疾病臨床治療的發(fā)展方向和最有效的手段[1-5]。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，即凋亡素2配體 (apoptosis-2 ligand，Apo-2L)，是腫瘤壞死因子TNF 超家族成員之一[6]。TRAIL 對腫瘤細胞呈高選擇性的殺傷效應，可誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常組織細胞不敏感，有望成為新一代的抗腫瘤藥物[7]。但TRAIL應用于臨床還存在一些問題，例如：1)并非所有腫瘤細胞都對TRAIL敏感，比如非小細胞癌和多發(fā)性骨髓瘤等；2)出現(xiàn)天然耐藥或獲得性耐藥等情況。TRAIL敏感株篩選有利于癌癥醫(yī)療個體化，指導TRAIL的臨床個體化治療，從而提高療效，減輕不良反應，促進醫(yī)療資源的合理利用。B淋巴瘤的病理分類眾多，能夠廣泛用于B淋巴瘤的靶向藥物相對較少，本研究篩選TRAIL敏感的B淋巴瘤細胞株，并探討其凋亡誘導效應，對TRAIL應用于腫瘤個體化治療具有指導意義。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人B淋巴瘤細胞株Ramos、Raji、CA46、HTB60為本室保存，RPMI 1640完全培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。CCK-8購自Dojindo公司；EDTA-free的蛋白酶抑制劑Cocktail、Annexin V-PI及JC-1檢測試劑盒為Roche產(chǎn)品；抗人GAPDH、PARP、Casepase-3、Casepase-8、Goat anti Rabbit IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；碘化丙啶PI購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白質(zhì)預染Marker購自美國Fermentas公司；通用蛋白裂解抽提試劑購自BioTeke公司；化學發(fā)光底物Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate購自美國Millipore公司；DR4/DR5流式抗體購自美國BD公司；TRAIL由成都地奧九泓制藥廠提供。

1.2細胞培養(yǎng)與傳代

細胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中胎牛血清含量為10%；置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代，具體情況視細胞的生長速度而定。為保證無微生物污染，常規(guī)采用青霉素、鏈霉素抗細菌污染，并定期用去支原體抗生素處理。取對數(shù)生長期的細胞用于藥物實驗。

1.3細胞增殖測定

人B淋巴瘤細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的腫瘤細胞做增殖抑制實驗。細胞以104/孔的數(shù)目鋪板于96孔板中，加入TRAIL作用24 h后，再加入10 μL/孔的CCK-8，4 h后在A450 nm處測定其吸光值。細胞抑制率(IC)=(1-OD實驗組平均值/OD對照組平均值)×100%。

1.4細胞表面TRAIL受體—DR4/DR5表達測定

采用DR4/DR5流式抗體染色人B淋巴瘤細胞30 min，并以未染色的細胞為同性對照，流式細胞儀測定其在細胞表面的表達情況。

1.5細胞凋亡測定

TRAIL作用Ramos細胞12 h，離心得細胞，洗滌后，用雙染試劑Annexin V-FITC/PI染色15～20 min， 離心、洗滌，用染色Buffer重懸后，流式細胞儀測定FITC/PI對應的熒光通道，正常細胞為FITC-/PI-，凋亡早期細胞為FITC+/PI-，凋亡晚期及壞死細胞為FITC+/PI+。

1.6線粒體膜電位檢測

JC-1染色液是一種用于檢測細胞線粒體膜電位改變(△Ψm)的熒光探針。JC-1染料探針是以電勢依賴方式積聚在線粒體中，在正常細胞的線粒體中，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合物并發(fā)紅色熒光；在損傷的線粒體中，其細胞膜電位下降或喪失，JC-1以單體形式存在于細胞的胞漿中，發(fā)綠色熒光。所以，測定細胞JC-1熒光的變化，可以直接反映△Ψm。

JC-1檢測細胞線粒體膜電位時，將TRAIL作用后的Ramos細胞及其對照離心洗滌后，JC-1探針37 ℃，染色20 min，洗滌后PBS重懸，流式細胞儀檢測其在細胞內(nèi)紅/綠熒光強度的比例分布，進而判定細胞膜電位的改變狀態(tài)。

1.7Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白

TRAIL作用后，Ramos細胞離心、洗滌，根據(jù)鋪板細胞數(shù)加入相應體積的細胞裂解液，冰上放置30 min，離心得蛋白溶液，BCA 法定量蛋白濃度；SDS-PAGE電泳后，PVDF轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉37 ℃，封閉60 min，一抗(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，洗滌后，二抗37 ℃，孵育1.5 h，化學發(fā)光液ECL顯色，化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。GAPDH為內(nèi)參蛋白，以樣品中目的蛋白的光密度值/相應 GAPDH的光密度值，反映目的蛋白的相對水平。

1.8統(tǒng)計學方法

2　結(jié)果

2.1Ramos淋巴瘤細胞為TRAIL敏感株

為觀察TRAIL對B淋巴瘤細胞的增殖抑制作用，利用CCK-8法檢測TRAIL不同藥物濃度(0～50 μg/mL)壓力下，作用24 h后，對B淋巴瘤細胞的生長抑制率。結(jié)果顯示，TRAIL對Ramos、HTB60、CA46細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為60 ng/mL、0.4 μg/mL和24 μg/mL；而Raji細胞抑制結(jié)果顯示，即使是高濃度(50 μg/mL)的TRAIL，對細胞的生長抑制率也只有25%。對TRAIL而言，當100 ng/mL TRAIL作用于腫瘤細胞，其對細胞增殖抑制率達不到50%時，則被定義為該細胞株對TRAIL不敏感。即Ramos淋巴瘤細胞是TRAIL的敏感株，HTB60和CA46為其不敏感株，Raji為其耐藥株(圖1)。

2.2B淋巴瘤細胞表面受體DR4/DR5的表達與TRAIL敏感性相關(guān)

IC50結(jié)果顯示，TRAIL對B淋巴瘤細胞的抑制能力是Ramos>HTB60>CA46 >Raji。流式檢測細胞表面的TRAIL 受體-DR4/DR5的表達，從所測數(shù)據(jù)(把DR4和DR5的表達求和并平均)來看，Ramos、HTB60、CA46、Raji細胞死亡受體的表達分別為52.8%、43.1%、35.6%、16.1%，可見藥物敏感與死亡受體表達量趨勢一致。Ramos細胞表面受體DR4/ DR5表達最高，TRAIL對其抑制效果最好。

圖2B淋巴瘤細胞表面受體DR4/DR5表達

2.3TRAIL對Ramos淋巴瘤細胞的誘導凋亡效應

為確定TRAIL對Ramos細胞的增殖抑制作用是否由細胞凋亡引起，研究采用Annexin V-FITC/PI 雙染的方法，通過流式細胞儀檢測經(jīng)不同濃度TRAIL處理12 h后的Ramos細胞的凋亡誘導效應，結(jié)果顯示，TRAIL作用濃度分別為100、50、25、0 ng/mL時，誘導細胞凋亡比例依次為42.1%、30.4%、16.5%、4.8%，結(jié)果顯示，與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即TRAIL對Ramos細胞的增殖抑制作用由誘導細胞凋亡介導(圖3)。

2.4TRAIL引起Ramos細胞線粒體膜電位下降

TARIL處理Ramos細胞12 h后，細胞經(jīng)JC-1染色，流式細胞儀檢測其線粒體膜電位，結(jié)果顯示，TARIL作用濃度分別為100、50、25、0 ng/mL時，Ramos細胞△Ψm的比例依次為42.8%、29.6%、22.1%、4.7%。由此可見，TARIL處理Ramos細胞后，可引起細胞線粒體膜電位下降，與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖3Annexin V-FITC/PI檢測Ramos細胞凋亡

注：A.流式結(jié)果圖；B.統(tǒng)計學分析結(jié)果；與CN比較，*P<0.05

圖4JC-1檢測Ramos細胞線粒體膜電位

注：A.流式結(jié)果圖；B.統(tǒng)計學分析結(jié)果；與CN比較，*P<0.05

2.5TRAIL對Ramos細胞凋亡蛋白的活化情況

TRAIL誘導Ramos細胞凋亡，并引起線粒體膜電位明顯下降。線粒體凋亡途徑中，標志性蛋白是否參與了Ramos細胞的凋亡過程，利用Western Blot技術(shù)對該信號通路中的凋亡蛋白Caspase-9，Caspase-3及PARP進行了測定。結(jié)果顯示，TRAIL促進線粒體凋亡途徑的標志蛋白Caspase-9活化，Cleaved Caspase-9表達增加；活化下游調(diào)亡蛋白Caspase-3和PARP，表達Cleaved Caspase-3及Cleaved PARP，與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖5Western Blot 檢測凋亡蛋白的表達

注：A.Western Blot結(jié)果圖；B.統(tǒng)計學分析結(jié)果；與CN比較，*P<0.05

3　討論

TRAIL具有選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞幾乎無影響的特性，有望成為新一代的抗腫瘤藥物[8]，但并非所有腫瘤細胞都對TRAIL敏感。有報道[7]顯示，部分癌細胞對TRAIL引發(fā)的凋亡作用的敏感性較低甚至有完全耐受的現(xiàn)象，特別是在腫瘤化療過程中逐漸累積產(chǎn)生的獲得性耐受。因此，篩選TRAIL藥物敏感株是推進其臨床應用亟待解決的關(guān)鍵問題。

TRAIL通過與表達在細胞表面的特異性受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學功能，而目前發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體一共有以下5種：TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5、TRAIL-R3/DcR1、TRAIL-R4/DcR2和OPG。根據(jù)其功能與結(jié)構(gòu)的不同，可分為3類：1)死亡受體：DR4和DR5；2)誘騙受體：DcR1和DcR2；3)可溶性受體：OPG。其中，主要發(fā)揮凋亡介導作用的是死亡受體DR4和DR5。本研究結(jié)果顯示，Ramos細胞為TRAIL敏感株；供試的4株B淋巴瘤細胞其受體DR4/DR5表達量與TRAIL敏感性相關(guān)聯(lián)，更多的細胞株測試將有助于確定該結(jié)論。TRAIL耐藥株可以通過化療藥等藥物逆轉(zhuǎn)其對TRAIL的耐受，比如上調(diào)DR4或DR5表達來逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對TRAIL的耐受[9-10]。

TRAIL與DR4/DR5特異性結(jié)合后，誘導DR4/DR5形成同源或異源二聚體，該二聚體招募FADD，F(xiàn)ADD通過它的死亡效應結(jié)構(gòu)域與Caspase-8的相應區(qū)域結(jié)合，激活Caspase-8及其下游效應蛋白Caspase-3，啟動細胞調(diào)亡[8]。另外，證實TRAIL誘導Ramos細胞凋亡，引起線粒體膜電位明顯下降，促進線粒體凋亡途徑的標志蛋白Caspase-9活化，最終活化下游調(diào)亡蛋白Caspase-3和PARP，說明線粒體調(diào)亡途徑是TRAIL引起Ramos細胞凋亡的途徑之一。

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Study on the Sensitivity of TRAIL in B Lymphoma Cell Lines and TRAIL-induced Apoptosis

QingXiaoling1，ChenZhimin1，ChenYu1，WangHong1，LiYan1，YuYun2，YuXiaofeng1，YinChunli1，YaoShuangqun1，TianMaocheng1，YangPing2，LiMinhui3△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China；3.CenterofScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

ObjectiveTo investigate the sensitivity of TRAIL in B lymphoma cell lines and the mechanism of Ramos apoptosis induced by TRAIL via the mitochondrial signaling pathways. MethodsThe CCK-8 assay was adopted to detect the tumor cell proliferation. The flow cytometry was used to analyze the cell mitochondrial membrane potential, the cell surface receptors DR4/DR5 expressions and the changes of apoptosis. The Western Blot Test was employed to test the expression levels of apoptosis protein after 24 hours with TRAIL stimulation. Results Among the 4 B lymphoma cell lines, Romas cells are the sensitive cell strain to TRAIL and the DR4/DR5 expression levels were significantly higher than the drug-resistant strains of TRAIL. TRAIL inhibited Ramos cell proliferation by inducing the cell apoptosis accompanied by the significant changes of mitochondrial membrane potential. The results of Western-Blot Analysis indicated that the apoptotic signal molecules such as Caspase-9, Caspase-3 and PARP were significantly activated. ConclusionThe sensitivity of the 4 experimental B lymphoma cell lines to TRAIL is different and it is related to the DR4/DR5 expressions. TRAIL inhibits cell proliferation of Ramos Cells, induces their apoptosis, decreases the mitochondrial membrane potential significantly, and activates Caspase-9 and Caspase-3. Mitochondrial apoptosis pathway is one of the ways to mediate the apoptosis of Ramos cells induced by TRAIL.

TRAIL; B lymphoma; Apoptosis; Mitochondrial signaling pathways

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.005

四川省教育廳項目(No:13ZB0220)；四川省科技廳項目(No:2015JY0205)；四川省衛(wèi)生廳項目(No:130302,130298)；國家級大學生創(chuàng)新項目(No:201313705007,201313705003,201413705005)；成都醫(yī)學院科研基金(No:CYZ11-005)

李敏惠，E-mail：252710700@qq.com

R730.5

A

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1056.020.html