甜瓜蒂中葫蘆素提取工藝初探及其含量測定*

魏　榕，伍忠軍，楊瑪麗，肖　翠，曹小華，陽　泰，劉　進(jìn)△

1.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都　610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都　610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都　610500)

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甜瓜蒂中葫蘆素提取工藝初探及其含量測定*

魏榕1，伍忠軍1，楊瑪麗2，肖翠1，曹小華1，陽泰3，劉進(jìn)3△

1.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都610500)

目的比較65%乙醇和無水乙醇回流提取法從甜瓜蒂中提取葫蘆素的效率；同時比較甜瓜蒂纖維和甜瓜蒂粉末中葫蘆素含量的差異。方法分別采用65%乙醇和無水乙醇加熱回流法制備甜瓜蒂粉末提取液；采用無水乙醇加熱回流法制備甜瓜蒂纖維提取液。通過HPLC測定提取液中葫蘆素B、E和I的濃度。結(jié)果甜瓜蒂粉末采用無水乙醇制備的提取液中葫蘆素B、E濃度均高于65%乙醇制備的提取液中葫蘆素B、E濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但葫蘆素I濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。甜瓜蒂纖維采用無水乙醇制備的提取 液中也含有較高濃度的葫蘆素B、E、I。結(jié)論采用乙醇加熱回流法從甜瓜蒂中提取葫蘆素，無水乙醇提取效率高于65%乙醇。甜瓜蒂粉末中葫蘆素含量雖高于甜瓜蒂纖維，但甜瓜蒂纖維中仍有較高含量的葫蘆素，不應(yīng)當(dāng)作廢棄物處理。

甜瓜蒂；葫蘆素；提取工藝

葫蘆素是一類從葫蘆科植物中分離得到的四環(huán)三萜類化合物，類型有葫蘆素A、B、C、D、E、F和I等。植物次生代謝產(chǎn)物研究[1]表明，植物產(chǎn)生葫蘆素B和E后，可通過代謝葫蘆素B和E產(chǎn)生其他類型葫蘆素。甜瓜蒂為葫蘆科甜瓜屬植物甜瓜CucumismeloL.的果梗，是提取、制備葫蘆素類化合物的重要原料[2]。從甜瓜蒂中提取葫蘆素，主要采用乙醇提取法，有研究[3]比較了55%、75%以及95%乙醇，最后優(yōu)選55%乙醇用于甜瓜蒂中葫蘆素提取。亦有研究[4]報道優(yōu)選65%乙醇提取甜瓜蒂中葫蘆素B。在一定范圍內(nèi)，含水量大雖可提高產(chǎn)品的一次性提取率，但會降低提取物的純度[5]。因此，本研究著重比較65%乙醇濃度和無水乙醇回流提取法提取甜瓜蒂中葫蘆素的效率。但目前大多研究[6-7]僅報道了甜瓜蒂粗粉在甜瓜蒂提取工藝中的使用，未見報道甜瓜蒂纖維中葫蘆素含量的測定。本研究將測定甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維中葫蘆素含量，以判斷甜瓜蒂纖維是否可以作為提取原料使用。

甜瓜蒂中葫蘆素主要含有葫蘆素B、E[2]，因此，本研究將通過測定提取物中葫蘆素B和E的含量來比較提取效率。另外葫蘆素I被認(rèn)為具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性，本研究同時測定了葫蘆素I的含量，以了解葫蘆素I是否也是決定中藥甜瓜蒂藥效的關(guān)鍵組分。

1　儀器與試藥

1.1儀器

美國Waters2695液相色譜儀；瑞士Buchi公司R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；梅特勒托利多ME104分析天平；Millipore A10超純水機(jī)。

1.2試藥

甜瓜蒂藥材(產(chǎn)地：山東省萊西市馬連莊鎮(zhèn))，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室游元元教授鑒定為葫蘆科植物甜瓜的干燥果蒂；葫蘆素B對照品(純度 ≥ 98.67%)購于成都曼思特科技有限公司，批號：MUST-16022208；葫蘆素E對照品(純度 ≥ 95%)購于成都曼思特科技有限公司，批號：MUST-12092801；葫蘆素I(純度 ≥ 98%)購于美國Cayman Chemical公司；乙醇(分析純，成都市科龍化工試劑廠)，甲醇(色譜純，美國賽默飛公司)。

2　方法

2.1色譜條件

C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Kromasil公司)；流動相：甲醇-水(65∶35，V/V)；流速：0.8 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量 5 μL。在此色譜條件下，供試品中葫蘆素I、B、E的保留時間分別為8.5、11.5、13.2 min，與相鄰色譜峰的分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按葫蘆素I、B、E計算分別不低于8 935、 10 767、 10 351(圖1A-1B)。

2.2供試品溶液的制備

使用粉碎機(jī)破碎甜瓜蒂，得甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維。稱取25 g甜瓜蒂粉末和25 g甜瓜蒂纖維，浸泡于250 mL無水乙醇，另稱取25 g甜瓜蒂粉末浸泡于250 mL 65%乙醇中。80 ℃水浴加熱回流提取，重復(fù)提取3次，每次1 h，將3次的提取液合并轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶，加入無水乙醇定容至500 mL。

2.3對照品溶液的制備

稱取2.2 mg葫蘆素B、1.3 mg葫蘆素E和2.5 mg葫蘆素I，分別加入10 mL容量瓶中使用甲醇定容。對照品溶液中葫蘆素B、E、I溶液濃度分別為：220、130、250 μg/mL。

2.4線性關(guān)系考察

2.5精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液，按2.1色譜條件，單次進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。葫蘆素B、E、I峰面積的RSD分別為1.49%、1.39%、1.58% (n=5)，說明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫放置，于0、4、8、10、12 h， 按2.1色譜條件單次進(jìn)樣5 μL。供試品中葫蘆素B、E、I峰面積RSD分別為1.63%、1.46%、1.52% (n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在室溫12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.1色譜條件單次進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次。葫蘆素B、E、I的峰面積RSD分別為1.37%、1.52%、1.47% (n=5)，結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

圖1葫蘆素對照品和甜瓜蒂無水乙醇提取物供試品的HPLC色譜圖

注：A.葫蘆素I、B、E 3種對照品混合溶液；B.甜瓜蒂無水乙醇提取物供試品溶液；1-葫蘆素I；2-葫蘆素B；3-葫蘆素E

2.8加樣回收率試驗(yàn)

稱取6份已測定含量的供試品適量置于10 mL容量瓶，加入混合對照品溶液5 mL，使用甲醇定容。按2.1色譜條件單次進(jìn)樣5 μL，測定葫蘆素B、E、I峰面積并計算含量。葫蘆素B、E、I的平均回收率分別為101.82%、104.53%、99.07%，RSD分別為1.42%、1.71%、1.58%(n=6)。

2.9統(tǒng)計學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1不同乙醇濃度加熱回流提取甜瓜蒂中葫蘆素的效率比較

采用65%乙醇和無水乙醇作為提取液對甜瓜蒂粉末進(jìn)行加熱回流提取，HPLC測定提取液中葫蘆素B、E、I濃度，提取操作重復(fù)3次。結(jié)果表明，采用無水乙醇制備的甜瓜蒂提取液中葫蘆素B、E的濃度均高于65%乙醇的提取液，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但葫蘆素I的濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1　　　　65%乙醇和無水乙醇提取液中葫蘆素濃度比較

3.2甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維中葫蘆素B、E、I含量比較

采用無水乙醇加熱回流分別提取甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維，HPLC測定兩種提取液中葫蘆素B、E、I濃度，計算甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維中葫蘆素含量，提取操作重復(fù)3次，結(jié)果表明，每克甜瓜蒂粉末中葫蘆素B、E、I含量均高于甜瓜蒂纖維，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2　甜瓜蒂粉末和甜瓜蒂纖維葫蘆素含量比較±s，mg/g，n=3)

4　討論

本研究表明，無水乙醇加熱回流提取比65%乙醇加熱回流從甜瓜蒂中提取葫蘆素效率更高。既往研究[4-5]也有比較55%、75%、95%乙醇以及不同料液比對葫蘆素B提取效率的影響，但提取物中含有的水分影響了下一步的保存或純化工作。無水乙醇回流提取液中葫蘆素主要成分葫蘆素B和E含量均高于65%乙醇，且最終產(chǎn)物中水份少，便于乙醇回收和純化工作。

甜瓜蒂提取首先需將甜瓜蒂粉碎，但甜瓜蒂是甜瓜的梗部，含有大量纖維。以往研究[6-7]報道僅使用甜瓜蒂粉末，而未將甜瓜蒂纖維作為原料使用。本研究表明：盡管甜瓜蒂纖維中葫蘆素含量低于甜瓜蒂粉末，但甜瓜蒂纖維中依然有較高含量的葫蘆素，甜瓜蒂提取工藝中產(chǎn)生的大量纖維不應(yīng)作為廢棄物丟棄。

葫蘆素I被認(rèn)為具有更強(qiáng)大的抗腫瘤活性，葫蘆素I可以通過激活RhoA/ROCK途徑和抑制LIM激酶，抑制肌動蛋白和磷酸肌球蛋白Ⅱ共聚體的形成，影響細(xì)胞的遷移和分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。葫蘆素I還可以下調(diào)Aurora kinase A、Aurora kinase B 和Survivin表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期在G2/M[9]；同時還能抑制STAT3磷酸化抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10]。既往研究忽視了甜瓜蒂中葫蘆素I的含量測定，本研究測定結(jié)果表明甜瓜蒂中有較高含量的葫蘆素I。葫蘆素I可能也是決定中藥甜瓜蒂藥效的關(guān)鍵組分，其含量和生物活性應(yīng)該引起重視。

綜上所述，本研究證實(shí)了無水乙醇加熱回流提取甜瓜蒂中葫蘆素的效率高于65%乙醇，同時還發(fā)現(xiàn)甜瓜蒂纖維中也有較高含量葫蘆素，可作為提取原料使用；通過對比葫蘆素I標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)現(xiàn)甜瓜蒂也有較高含量的葫蘆素I。但液相色譜的結(jié)果并不能確定被測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此在未來的研究中還需要通過高效液相與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)一步確認(rèn)。

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Preliminary Study on the Extraction Process of Cucurbitacin from Cucumis Melo Pedicle and its Content Determination

WeiRong1,WuZhongJun1,YangMali2,XiaoCui1,CaoXiaohua1,YangTai3,LiuJin3△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofMedicalLaboratorySciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.CenterforScientificResearch,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo study and compare the extraction process of cucurbitacin from dry Cucumis melo pedicle by the heating reflux method with 65% ethanol and anhydrous ethanol and compare the cucurbitacin content of fibers and powders of Cucumis melo pedicle. MethodsThe powder extraction solution of Cucumis melo pedicle was prepared by the heating reflux method with 65% ethanol and anhydrous ethanol, and the fiber extraction solution was prepared by the heating reflux method with anhydrous ethanol. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method was adopted to assay the concentration of cucurbitacin B, E and I in the extraction solution. ResultsThe concentration of cucurbitacin B and E in the extraction solution obtained by anhydrous ethanol was significantly higher than in the extraction solution obtained by 65% ethanol (P<0.05), but there was no significant difference in the concentration of cucurbitacin I between the two groups (P>0.05). The fibers of Cucumis melo pedicle contained the relatively high concentrations of cucurbitacin B, E and I. Conclusion Anhydrous ethanol is more effective in the heating reflux method than 65% ethanol in extracting the cucurbitacin. The content of cucurbitacin in powders of Cucumis melo pedicle is much higher than in its fibers, but the fibers should not be discarded as waste since it contains the relatively high concentration of cucurbitacin.

Cucumis melo pedicle; Cucurbitacin; Extraction process

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81201668)；四川省教育廳基金資助項(xiàng)目(No：15ZB0234)；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項(xiàng)目(No：201413705032)

劉進(jìn)，E-mail：jinliu19871987@163.com

R284.2

A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.0958.002.html