白術(shù)多糖對運動應(yīng)激性潰瘍大鼠抗氧化作用和胃黏膜Bcl-2，Bax表達影響的實驗研究

曹艷霞，白光斌

(1.榆林學(xué)院 體育學(xué)院， 陜西 榆林　716000； 2.西安電子科技大學(xué) 體育部, 陜西 西安　710071)

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白術(shù)多糖對運動應(yīng)激性潰瘍大鼠抗氧化作用和胃黏膜Bcl-2，Bax表達影響的實驗研究

曹艷霞1，白光斌2

(1.榆林學(xué)院 體育學(xué)院， 陜西 榆林716000； 2.西安電子科技大學(xué) 體育部, 陜西 西安710071)

探討白術(shù)多糖對運動應(yīng)激性潰瘍(Stress-Ulcer,SU)大鼠抗氧化和胃黏膜Bcl-2、Bax表達的影響。選擇雄性SD大鼠30只為實驗動物,隨機分為對照組、運動應(yīng)激性潰瘍組(SU)、白術(shù)多糖組,對照組不運動,SU組及白術(shù)多糖組采用遞增負荷的方式進行8周跑臺運動。實驗結(jié)束檢測大鼠腺胃組織潰瘍指數(shù);測定大鼠胃組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,用免疫組化法測定各組大鼠胃黏膜Bcl-2、Bax表達。與對照組比較,SU組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯升高,胃組織SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高,Bcl-2蛋白表達減少,Bax蛋白表達增強,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與SU組比較,白術(shù)多糖組大鼠胃潰瘍指數(shù)明顯降低,胃組織SOD活性顯著提高,MDA含量顯著下降,Bcl-2蛋白表達增強,Bax蛋白表達減少,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。白術(shù)多糖能抑制SU,其可能機制與胃黏膜抗氧化能力提高,Bcl-2表達增強,Bax表達減少,增加Bcl-2/Bax 比值的作用有關(guān)。

白術(shù)多糖;運動應(yīng)激性潰瘍;Bcl-2;Bax

應(yīng)激性潰瘍(stress ulcer,SU)是指機體在各類應(yīng)激狀態(tài)下所引起的胃或十二指腸等部位發(fā)生急性糜爛、潰瘍,主要表現(xiàn)為上消化道出血,少數(shù)可并發(fā)穿孔[1]。由運動引起的應(yīng)激性潰瘍稱運動應(yīng)激性潰瘍。運動應(yīng)激性胃潰瘍已成為影響運動員正常訓(xùn)練和比賽的一個較為突出的問題,但其發(fā)病機制尚未完全清楚[2]。近些年,關(guān)于中藥白術(shù)的藥理作用的研究較多,白術(shù)對于改善和提高機體的免疫力、抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸道功能等多種作用,但對白術(shù)中有效成分白術(shù)多糖(Atractylodes macrocephalaon polysaccharides)的研究還較少,白術(shù)多糖不但能夠提高免疫力,而且具有抗應(yīng)激、抗氧化作用,而且還能調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)和血液及造血系統(tǒng)[3-4]。但是白術(shù)多糖對運動應(yīng)激導(dǎo)致的胃潰瘍大鼠胃黏膜細胞Bcl-2和Bax表達是否具有干預(yù)作用,還未見研究。

為此，我們通過動物實驗以探討白術(shù)多糖對運動應(yīng)激性胃潰瘍的影響及其可能機制,并且通過測試胃黏膜中SOD活性和MDA含量、Bcl-2和Bax表達水平的變化探討其可能發(fā)病的機制,從而為防治運動應(yīng)激性胃潰瘍提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及其分組

實驗動物為雄性SD大鼠30只,購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物管理中心,3月齡,體重180g～220g,動物室內(nèi)溫20～29°C,相對濕度40%～55%,隨機分為3組:對照組(10只),SU組(10只),白術(shù)多糖組(10只),各組大鼠均在相同條件下自由飲水和覓食。

1.2藥物和主要試劑

白術(shù)多糖購于南京澤朗生物科技有限公司,多糖含量大于95%,使用培養(yǎng)液稀釋成0.05g/L。白術(shù)多糖(1mL/100g))組于灌胃前20min進行,對照組則灌入等體積的蒸餾水,每兩天稱一次體重。MDA、SOD的檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。兔抗鼠Bcl-2 和Bax 抗體免疫組化以及相關(guān)的免疫組化試劑,均購于北京中彬金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3實驗方案

1.3.1運動應(yīng)激性胃潰瘍模型的建立① 對照組:正常籠內(nèi)生活,不進行任何訓(xùn)練,每天補充同劑量的蒸餾水((1mL/100g);② SU和白術(shù)多糖組:對大鼠進行每周5次,共8周的遞增負荷訓(xùn)練,SU組訓(xùn)練前30min蒸餾水灌胃(1mL/100g),白術(shù)多糖組訓(xùn)練前30min白術(shù)多糖水提液灌胃(1mL/100g)。大鼠先進行一周的適應(yīng)性訓(xùn)練,然后進行每周5次,共8周的遞增負荷的方式進行跑臺運動。每次訓(xùn)練前起始速度為15m/min,持續(xù)時間為10min,運動方案的制定結(jié)合參考趙敬國的研究進行修改,每周訓(xùn)練5d,休息2d,10min以后速度以3m/min開始遞增,持續(xù)時間為5min,速度遞增為為20m/min后不再改變,維持此速度運動40min,跑臺坡度為3度。整個訓(xùn)練過程可用毛刷刺激和電刺激來強迫大鼠進行跑臺訓(xùn)練。

1.3.2儀器設(shè)備與觀察指標(biāo)測定動物于末次訓(xùn)練后,按50mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉,然后快速剖腹取出胃,用濾紙把周圍血跡吸取干凈后,再沿大彎將胃側(cè)剪開來然后展開鋪平,按照Guth的標(biāo)準(zhǔn)進行潰瘍指數(shù)和潰瘍抑制率的計算,根據(jù)胃組織潰瘍面積的大小計量評分,斑點狀糜爛(0～1mm),記作1分;糜爛為1mm,記作2分;糜爛為1mm≤2mm,記作3分;糜爛為2mm≤3mm,記作4分,依此類推,損傷寬度超過1mm,潰瘍指數(shù)加倍;胃黏膜MDA、SOD的檢測均參照試劑盒說明書進行。迅速取腺胃組織(1mm2)左右放入4%的中性甲醛中固定,以備光鏡制樣;同時將胃竇稱重,接著按比例加入冷生理鹽水制備10%的胃黏膜組織勻漿液,離心(3000rpm,10min,4℃),然后取上層清液,置于-20度冰箱保存,待測SOD、MDA。胃黏膜Bax 和Bcl-2 基因蛋白表達檢測采用免疫組化法檢測,Bax和Bc-2蛋白表達,以PBS替代一抗為陰性對照。操作完全按試劑盒說明進行,每張切片隨機測定5個視野取平均值。Bcl-2和Bax蛋白的表達產(chǎn)物主要位于胞漿,少部分位于胞膜或核膜,呈棕褐色或者棕黃色顆粒狀,胞核復(fù)染后呈現(xiàn)出藍色。所有標(biāo)本均進行吸光度值測定。吸光度值大則陽性表達強,吸光度值小則陽性表達弱,即切片陽性表達的強弱與吸光度值呈正相關(guān)。

1.3.3光鏡制樣及觀察胃底部周圍組織;10%的甲醛進行固定;將乙醇配置成各種濃度,自低濃度至高濃度循序進行逐級脫水;選用二甲苯作為透明劑進行透明處理;全自動組織包埋機進行浸蠟和包埋;切片機進行連續(xù)切片,再展片,貼片;蘇木精和伊紅進行染色;中性樹脂膠封片,然后進行拍照。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果與分析

2.1各組大鼠體重的變化

由表1可知,實驗前,各組大鼠體重?zé)o明顯差異,持續(xù)進行8周的訓(xùn)練后,各組大鼠體重均不同程度的增加,且對照組大鼠體重增加最為明顯,然后是白術(shù)多糖組,增加最少的是SU組,且SU組大鼠體重變化顯著低于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),白術(shù)多糖組大鼠體重變化顯著低于SU組,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1　白術(shù)多糖對各組大鼠體重的影響

**P<0.01 vs 對照組;# #P<0.01 vs SU組

2.2各組大鼠潰瘍指數(shù)

由表2可知，與對照組相比，SU組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)，與SU組比較，白術(shù)多糖組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)。

2.3各組大鼠胃內(nèi)SOD活性和MDA含量

由表3可知,與對照組相比,SU組大鼠腺胃組織MDA含量升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),與SU組比較,白術(shù)多糖組大鼠腺胃組織SOD活性降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表2　白術(shù)多糖對各組大鼠潰瘍指數(shù)的影響

**P<0.01 vs 對照組;# #P<0.01 vs SU組

組別MDA(nmol/mgprot)SOD(NU/mgprot)對照組0.61±0.034125.89±0.49SU組1.05±0.035**68.42±1.19**白術(shù)多糖組0.73±0.114##109.83±7.61##

**P<0.01 vs 對照組;# #P<0.01 vs SU組

2.4各組大鼠胃黏膜Bcl-2和Bax表達的變化

由表4可知，與對照組相比，SU組大鼠大鼠胃黏膜Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增強，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) ；與SU組比較，Bcl-2蛋白表達增強，Bax蛋白表達減少，均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) 。

2.5白術(shù)多糖對各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響

白術(shù)多糖對各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響×200,HE染色,見圖1。

組別Bcl-2/%Bax/%Bcl-2/Bax對照組617.5±1.504.44±0.764.05±0.81SU組614.8±1.62**19.09±2.04**0.79±0.16**白術(shù)多糖組616.0±0.72##16.46±0.54##0.97±0.06##

**P<0.01 vs 對照組;# #P<0.01 vs SU組

圖1　胃黏膜組織病理學(xué)變化(×200)(A 對照組;B SU組;C 白術(shù)多糖組)Fig.1　Gastric histopathological changes (×200)A 對照組:胃壁較厚,彈性較好,且胃內(nèi)有少量食物殘渣,不存在血性內(nèi)容物,腺胃部黏膜呈淡紅色,黏膜表面未見充血水腫和潰瘍出血灶;B SU組:胃壁較薄,彈性差,且胃內(nèi)可見食物殘渣,混有咖啡色樣血性黏液,腺胃部黏膜呈深紅色,黏膜表面明顯充血水腫,呈點狀、條索狀或片狀出血;C 白術(shù)多糖組:胃壁稍薄,彈性尚可,胃內(nèi)有少量血性內(nèi)容物,腺胃部黏膜呈紅色,黏膜輕微充血水腫,伴有散在出血點或條索狀出血點,多位于黏膜的褶皺處。

3　分析與討論

在運動訓(xùn)練過程中,通過測試體重可以了解運動負荷對機體的影響以及機體對運動負荷的適應(yīng)狀況。若體重進行性下降,則可能是訓(xùn)練負荷與機體功能不相適應(yīng)造成的[3]。本實驗結(jié)果顯示,所有組別的大鼠經(jīng)過8周的飼養(yǎng)與訓(xùn)練后體重均有不同程度的增加,且SU組大鼠體重增長速度顯著低于對照組,這可能是由于運動強度較大,抑制胃腸道功能,影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收,影響了實驗動物的正常生長;白術(shù)多糖組大鼠體重變化顯著低于SU組,白術(shù)多糖干預(yù)后體重增長緩慢的趨勢得到抑制,且與對照組大鼠比較體重變化無顯著性差異,且該組大鼠外觀上看起來毛色光澤度好且平整,食欲良好,訓(xùn)練過程中的表現(xiàn)明顯優(yōu)于SU組,說明白術(shù)多糖可能通過改善運動大鼠胃腸系統(tǒng)及其它生理功能,有抑制大強度運動造成的動物體重下降的趨勢。

潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率是反映胃黏膜損傷程度的重要指標(biāo),胃潰瘍一旦發(fā)生,潰瘍指數(shù)就會增加,該指數(shù)是客觀評定潰瘍程度的指標(biāo)[4]。 研究結(jié)果表明,與對照組進行比較后發(fā)現(xiàn)SU組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)明顯升高,這可能是由于長時間的大強度運動造成了大鼠過度應(yīng)激,使得皮質(zhì)醇和促腎上腺皮質(zhì)激素等含量顯著增高,也可能是由于大強度運動導(dǎo)致的細胞動態(tài)平衡改變(無氧代謝產(chǎn)物的堆積)被骨骼集中化學(xué)感受器察覺,刺激了促腎上腺素皮質(zhì)激素的生成,使得神經(jīng)內(nèi)分泌功能失調(diào)所致,另外運動時胃腸道血流量的減少、自由基的大量生成均會破壞胃腸道黏膜的完整性,也會導(dǎo)致潰瘍。與SU組比較,白術(shù)多糖組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)降低,抑制了由運動造成的潰瘍指數(shù)升高的趨勢,且光鏡下,白術(shù)多糖組大鼠胃黏膜的病理學(xué)損傷明顯減輕,其可能機制可能是與白術(shù)多糖能有效清除自由基,提高機體的抗氧化能力有關(guān),從而減少了細胞攻擊因子對細胞造成的損傷;也可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜生長抑素、PGE2a的含量,有效改善胃黏膜屏障的自我保護功能,減輕胃黏膜損傷,同時也可以通過調(diào)節(jié)下丘腦-腎上腺皮質(zhì)軸的活動,抑制運動造成的促腎上腺皮質(zhì)激素的持續(xù)分泌,減輕機體的應(yīng)激反應(yīng),從而有效減輕了了潰瘍的產(chǎn)生。

胃黏膜血流量分配不足的狀況下,可導(dǎo)致自由基大量的生成[5],運動特別是持續(xù)時間較長的劇烈運動,引起機體各器官系統(tǒng)產(chǎn)生強烈的應(yīng)激反應(yīng),從而使得交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)處于持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài),腎上腺素和去甲腎上腺素的大量釋放會導(dǎo)致胃黏膜動脈持續(xù)收縮,造成胃黏膜組織持續(xù)缺血,使得自由基的產(chǎn)生明顯增多[6]。自由基過度生成引起氧化應(yīng)激反應(yīng),這是誘導(dǎo)胃黏膜細胞凋亡的重要信號途徑[7]。自由基攻擊細胞膜、線粒體膜等生物膜系統(tǒng)后引起不飽和脂肪酸降解的終產(chǎn)物之一即為MDA,其含量是反映細胞脂質(zhì)過氧化程度的敏感性指標(biāo),可以間接的反應(yīng)出細胞遭受氧化應(yīng)激損傷的程度[8]。實驗結(jié)果表明,在急性誘發(fā)的大鼠SU的過程中,大鼠體內(nèi)超氧化物歧化酶 (SOD)的活性呈明顯降低的趨勢。大量的研究表明, SOD能有效地清除超氧陰離子自由基,從而保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷,對機體的氧化與抗氧化平衡方面起著至關(guān)重要的作用[9]。因此，SOD的活性高低可以間接反應(yīng)機體清除氧自由基和抗氧化方面的能力,而MDA含量的高低則間接反應(yīng)了機體生物膜系統(tǒng)(細胞膜、線粒體膜等)受自由基攻擊后損傷的程度。研究結(jié)果表明,SU組大鼠SOD活性明顯降低,而MDA含量增加,這說明大強度運動應(yīng)激自由基的生成使機體的胃黏膜組織氧化損傷水平明顯提高,而胃部組織內(nèi)自由基的增多會導(dǎo)致大量的SOD被消耗,同時自由基對于胃黏膜組織的攻擊也使胃組織中MDA含量增加,而白術(shù)多糖可以有效的抑制機體脂質(zhì)過氧化水平的提高,可以提高胃組織SOD的抗氧化作用,加強清理自由基的能力。這可能是由于白術(shù)多糖有很強的抗氧化應(yīng)激作用,促進SOD活性提高,另一方面與自由基結(jié)合,降低對SOD的消耗,從而可抑制運動引起的脂質(zhì)過氧化的作用,保護胃黏膜。

本實驗應(yīng)用免疫組化的方法檢測了Bax、Bcl-2 的基因蛋白表達,結(jié)果顯示,在運動的過程中,SU組大鼠伴隨MDA含量增加與SOD活性的下降,胃黏膜的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)受到影響,潰瘍的發(fā)生率也較高,同時Bax的表達明顯上升,Bcl-2 的表達明顯下降。經(jīng)過白術(shù)多糖干預(yù)過的SU大鼠胃黏膜Bcl-2表達上調(diào),Bax表達降低,說明白術(shù)多糖可抑制細胞凋亡。白術(shù)多糖對運動導(dǎo)致的應(yīng)激性潰瘍有保護作用,可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達,從而減輕運動應(yīng)激缺血時自由基等因素對胃黏膜的損傷。因此,可以考慮在大負荷量訓(xùn)練前,甚至在出現(xiàn)疲勞癥狀時就用白術(shù)多糖進行治療,可以提高機體的抗應(yīng)激能力,盡可能減少運動對胃腸道的損害。

4　結(jié)　語

結(jié)合本研究的初步結(jié)果,我們推測長時間大強度運動后,胃黏膜細胞中Bcl-2表達下調(diào),而Bax 表達上調(diào),Bcl-2/Bax 相對比率發(fā)生變化,使Bax相對過剩,同時胃黏膜SOD活性下降和MDA含量增高,促使胃黏膜上皮細胞凋亡的發(fā)生,誘發(fā)SU;白術(shù)多糖干預(yù)后,胃黏膜細胞中Bcl-2表達上調(diào),而Bax 表達下調(diào),Bcl-2/Bax 相對比率發(fā)生變化,同時胃黏膜SOD活性升高和MDA含量降低,從而有效抑制胃黏膜上皮細胞的凋亡。

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(編輯徐象平)

Experimental Study on Atractylodes Macrocephala Koidz Polysaccharides for Exercise Stress Ulcer Rats with antioxidant and Bcl-2 and Bax Expression in Gastric Mucosa

CAO Yan-xia1， BAI Guang-bin2

(1.Department of Physical Education, Yulin College, Yulin 719000, China; 2.Department of Physical Education, Xidian University Xi′an 710071，China)

To study the polysaccharide of rhizoma atractylodis macrocephalae on SU, antioxidation in rats and the effects of Bcl-2 and Bax expression. 30 male SD rats were randomly divided into tthree groups,Control Group,SU Group, PAM Group, Control Group did not trainning, SU and PAM Group using incremental treadmill for 8 weeks. End of rat glandular stomach ulcer index determined in gastric tissue of SOD activity and MDA content,Determined by Bcl-2, Bax expression in immunohistochemistry. Compared with Control Group,SU group ulcer index obviously increased, SOD activity significantly reduced, MDA content significantly increased, Bcl-2 protein expression reduced, Bax protein expression enhanced,they have statistics meaning (P<0.01); and SU group compared, PAM Group gastric ulcer index obviously reduced, SOD activity significantly improve, MDA content significantly declined, Bcl-2 protein expression enhanced, Bax protein expression reduced, they have statistics meaning(P<0.01). Atractylodes macrocephala koidz polysaccharides could inhibit SU, the possible mechanism of gastric mucosal antioxidation capacity, Bcl-2 expression, Bax expression decreased increases Bcl-ratios related to the role.

Polysaccharide of atractylodes macrocephala koidz; Exercise stress ulcer; Bcl-2; Bax

2016-05-24

2014年陜西省社會科學(xué)基金資助項目(2014N10);榆林市科技局產(chǎn)學(xué)研基金資助項目(2015CYX-07)

曹艷霞，女，陜西佳縣人，副教授，從事運動生理學(xué)與休閑體育研究。

G804.7

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-04-017