不同溫度貯藏鮮切生菜腐敗細(xì)菌的分離及鑒定

徐曉霞，陳安均，桑偉娜，鄧雯瑾，趙江欣，李家欣，劉興艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

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不同溫度貯藏鮮切生菜腐敗細(xì)菌的分離及鑒定

徐曉霞，陳安均*，桑偉娜，鄧雯瑾，趙江欣，李家欣，劉興艷

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

以鮮切生菜為材料，對不同貯藏溫度(0，4，10，25 ℃)貨架期終點(diǎn)腐敗細(xì)菌進(jìn)行分離純化，通過回接試驗(yàn)驗(yàn)證其腐敗性。從接種并發(fā)病的鮮切生菜中分離純化微生物，判斷是否與接種菌株一致，確定鮮切生菜的腐敗細(xì)菌。從不同溫度貯藏條件下共篩選出菌落形態(tài)差別比較明顯的菌株32株。通過16S rDNA序列進(jìn)行分類研究，確定該菌的分類地位，結(jié)合形態(tài)和生理生化特性進(jìn)行鑒定，確定各細(xì)菌所屬種。結(jié)果表明，不同溫度貯藏條件下鮮切生菜菌相較為復(fù)雜，其中革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢地位，主要包括假單胞菌(Pseudomonasspp.)、歐文氏菌(Erwiniaspp.)、泛菌(Pantoeaspp.)、氣單胞菌(Aeromonasspp.)、水拉恩菌(Rahnellaspp.)等革蘭氏陰性菌，此外還存在革蘭氏陽性菌芽孢桿菌(Bacillusspp.)。不同溫度貯藏條件下微生物菌相變化分析表明，熒光假單胞菌為鮮切生菜貯藏過程中的共有腐敗細(xì)菌。

鮮切生菜；貯藏溫度；腐敗細(xì)菌；分離；鑒定

鮮切生菜是指以新鮮生菜為原料，經(jīng)篩選、清洗、切割、殺菌、包裝等加工過程，再經(jīng)冷藏運(yùn)輸進(jìn)入超市、冷柜銷售或快餐食品企業(yè)的即食產(chǎn)品[1]。其不但符合消費(fèi)者對新鮮、衛(wèi)生、方便、環(huán)保及健康食品的需要，而且還可以滿足食品快餐業(yè)、團(tuán)體飲食業(yè)、軍事后勤供給的特殊需要，拓寬生菜原料的應(yīng)用范圍，實(shí)現(xiàn)生菜的綜合利用。近年來鮮切生菜的消費(fèi)量持續(xù)增加，具有巨大的市場前景和經(jīng)濟(jì)效益[2-4]。

鮮切生菜在流通過程中極易發(fā)生品質(zhì)變化，且微生物侵染是造成其在貯藏期腐敗變質(zhì)并限制產(chǎn)品流通和貨架期最主要的原因[5]。鮮切生菜腐敗變質(zhì)不僅導(dǎo)致其在冷藏條件下的貨架期很短、不便長途運(yùn)輸，同時(shí)造成了大量的經(jīng)濟(jì)損失，還存在一定的食品安全隱患，國外已有因食用鮮切制品致病的相關(guān)案例[6]，因此微生物引起的腐敗變質(zhì)的問題已成為鮮切生菜進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。國內(nèi)外對鮮切生菜的研究主要集中在保鮮技術(shù)、生理生化及品質(zhì)變化、清洗劑抑菌、清洗方式及微生物生長模型等領(lǐng)域[7-9]，對微生物的研究主要集中在引起食源性疾病的致病菌上[10-11]，對腐敗菌的研究較少，同時(shí)僅對鮮切生菜初始微生物及某一特定貯藏溫度的腐敗微生物進(jìn)行了研究[12]，鮮切生菜不同溫度貯藏過程腐敗菌的研究較少。由于貯藏條件的不同鮮切生菜中的微生物存在一定變化，因此所采取的保質(zhì)、保鮮方法具有較大的盲目性，對其貨架期的控制也難以達(dá)到預(yù)期的效果。所以對不同貯藏溫度下鮮切生菜腐敗細(xì)菌進(jìn)行研究能夠?yàn)檫M(jìn)一步有針對性的殺菌處理提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒，并為鮮切生菜加工過程進(jìn)行有效控制提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

1.1.1材料

生菜購買于雅安市農(nóng)貿(mào)市場，選擇新鮮、健壯、無機(jī)械傷、清潔、成熟度基本一致且無病蟲害的生菜作為供試材料，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃冰箱中備用。

1.1.2供試培養(yǎng)基及試劑

營養(yǎng)瓊脂，乳酸菌瓊脂培養(yǎng)基，假單胞菌選擇培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，錳鹽營養(yǎng)瓊脂，微球菌選擇培養(yǎng)基。用于PCR擴(kuò)增的試劑和擴(kuò)增引物購自天根生化科技(北京)有限公司和英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

冷凍離心機(jī)(Sorvall ST 16R)，美國Thermo Fisher Scientific公司；人工氣候箱(GZ-380-GSI)，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；PCR儀(PTC-200)，BIO-RAD公司；電泳儀(DY-A)，上?？颠_(dá)儀器廠；凝膠成像儀,Gel Doc XRBIO-RAD公司；生物安全柜(HR20-ⅡA2)，青島海爾特種電器有限公司；生化培養(yǎng)箱(BPC-250 F)，上海一恒科科學(xué)儀器有限公司；電熱手提式壓力蒸汽滅菌鍋(SYQ-DSX-280B)，上海申安醫(yī)療器械廠；超純水機(jī)(Milli-Q Gradient)美國Millipore公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1鮮切生菜的處理方法

新鮮生菜去除表面葉片經(jīng)流動(dòng)自來水沖洗，于無菌超凈工作臺(tái)中用75%的酒精滅菌的鋒利的不銹鋼刀去除中心桿莖并切分成長寬各3 cm左右的塊，切分好的生菜立即在250 IU/mL nisin+0.15%檸檬酸+0.05%雙乙酸鈉復(fù)合抑菌劑中浸泡2 min[10]，用4 ℃無菌蒸餾水清洗3次，用手動(dòng)果蔬甩干機(jī)去掉多余的水分，取200 g為1組，分為若干組，用0.02 mm聚乙烯保鮮袋包裝。當(dāng)天對第1組進(jìn)行微生物菌相分析，并記為0 d，其余組分別置于樂扣箱中，以保持鮮切生菜貯藏環(huán)境中的相對濕度，分別置于0，4，10，25 ℃下貯藏，在感官拒絕時(shí)分別取樣進(jìn)行微生物菌相分析。

1.2.2菌株的分離與純化

對不同貯藏溫度貨架期終點(diǎn)的鮮切生菜的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用選擇性培養(yǎng)基對菌落總數(shù)、芽孢桿菌、腸桿菌科、假單胞菌屬、乳酸菌和微球菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，培養(yǎng)條件見表1。

表1　不同微生物菌相培養(yǎng)條件

在無菌條件下準(zhǔn)確稱取樣品25 g，剪碎、混勻，放入225 mL無菌生理鹽水(質(zhì)量濃度8.5 g/L)中，充分搖勻之后用1 mL移液槍加入含有9 mL的生理鹽水試管中進(jìn)行10倍遞增稀釋，稀釋成所需濃度梯度，充分搖勻。選取合適梯度的稀釋液0.1 mL涂布在不同菌相的選擇性培養(yǎng)基上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，同時(shí)分別吸取0.1 mL空白稀釋液加入無菌平皿中作空白對照。

從不同貯藏溫度貨架期終點(diǎn)中的選擇培養(yǎng)基上挑取典型生長的形態(tài)不同的菌落，平板劃線法反復(fù)分離、純化，直至菌落的生長狀態(tài)和形態(tài)特征表現(xiàn)一致時(shí)得到純的菌落，純菌落斜面接種，培養(yǎng)后于4 ℃保存。

1.2.3菌株致病性試驗(yàn)

將活化后的菌株在適宜培養(yǎng)溫度下?lián)u床培養(yǎng)。吸取5 mL 8.5 g/L的生理鹽水對樣品離心洗脫，重復(fù)3次，最后加入5 mL生理水重懸菌液，生理鹽水作空白對照。根據(jù)菌液渾濁程度2倍稀釋至合適濃度，600 nm波長下比色，記錄OD值，每個(gè)稀釋濃度用傾注平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將腐敗菌按上述方法制備成菌懸液后，根據(jù)OD值稀釋至所需濃度，使用前用傾注平板法計(jì)數(shù)。以濃度約為105CFU/mL左右的菌懸液進(jìn)行鮮切生菜的致病性試驗(yàn)。

分離純化的菌株不一定為腐敗菌，通過回接試驗(yàn)驗(yàn)證其腐敗性。根據(jù)1.2.1切分處理好生菜后，利用微型噴霧器對鮮切生菜噴霧接種，以無菌水作對照處理，用手動(dòng)果蔬甩干機(jī)去掉多余的水分，取200 g為1組，用0.02 mm聚乙烯保鮮袋包裝，分別置于0，4，10和25 ℃條件下貯藏，每處理分3組，試驗(yàn)重復(fù)3次，特定時(shí)間取樣，觀察感病鮮切生菜外觀發(fā)病癥狀、發(fā)病速度與發(fā)病程度，確定它們在不同貯藏條件下的致病性，從而初步選擇出腐敗菌。根據(jù)柯赫氏法則，從接種并發(fā)病的鮮切生菜中分離純化微生物，將分離出的菌株與所接種菌株的菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)進(jìn)行比較，判斷是否與接種菌株一致，確定鮮切生菜的腐敗細(xì)菌。

1.2.4鮮切生菜腐敗細(xì)菌的鑒定

1.2.4.1腐敗細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特征

對腐敗細(xì)菌進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，觀察菌落的形狀、大小、透明度、表面狀態(tài)、邊緣結(jié)構(gòu)、隆起形狀、菌落顏色等，有些情況還應(yīng)注意菌落的黏度和氣味。挑取已分離、純化好的細(xì)菌單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察，描述細(xì)胞的形狀、顏色、有無芽孢并進(jìn)行顯微照相。 參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[13]、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]對細(xì)菌菌株進(jìn)行菌種的鑒定，各項(xiàng)生理生化試驗(yàn)每一處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4.2分子生物學(xué)鑒定

活化從不同溫度貯藏條件下鮮切生菜中已經(jīng)分離純化得到的細(xì)菌純菌株，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行單菌落DNA的提取。以提取的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物，正向引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1495r：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增在PCR儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系(30 μL)：上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL， 2×PCR Master Mix 15 μL，超純水12 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃終延伸5 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR產(chǎn)物由擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性檢索和比對分析，獲得與其同源性較高的相似序列，使用MEGA5.1進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1腐敗細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特征

鮮切生菜0，4，10和25 ℃貯藏至感官拒絕點(diǎn)時(shí)，利用純培養(yǎng)的方法，從不同選擇性培養(yǎng)基中共篩選出菌落形態(tài)差別比較明顯的菌株79株，其中革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢菌。根據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果去除重復(fù)菌株，通過回接實(shí)驗(yàn)，觀察感病鮮切生菜外觀發(fā)病癥狀、 發(fā)病速度與發(fā)病程度，確定它們在不同貯藏條件下的致病性，從而初步選擇出不同溫度條件鮮切生菜的腐敗細(xì)菌。于0，4，10和25 ℃分別篩選出8，8，10，8株腐敗細(xì)菌。0 ℃腐敗細(xì)菌為PSA4、MNA2、MSA5、PSA5、MAC3、PSA2、MAC1、NA2，4 ℃腐敗細(xì)菌為PSA2、NA2、NA9、PSA3、MNA1、NA5、MNA4，10 ℃腐敗細(xì)菌為NA1+、MRS0、MSA7、NA3、NA6、NA6、MAC4、MAC5、PSA3，25 ℃腐敗細(xì)菌為PSA1+、PSA2、NA9、PSA1、MAC4、NA6、MAC1、MNA1。部分微生物形態(tài)學(xué)照片見圖1，菌株形態(tài)學(xué)特征見表2，生理生化特征見表3。

圖1　部分分離微生物的形態(tài)學(xué)表征Fig.1　The separation of microbial morphology characterization

菌株編號(hào)細(xì)菌菌落特征細(xì)菌個(gè)體形態(tài),0PSA4、10MAC5、25PSA1+圓形,淺黃色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,不透明桿菌,無芽孢,單極鞭毛運(yùn)動(dòng)0MNA2、10NA1+擴(kuò)展,乳白色,無凸起,不整齊,褶皺,無光澤,濕潤,不透明桿菌,有芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)10MRS0+圓形,亮黃色,薄膜狀,扁平,有光澤,干燥,不透明短桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)4PSA、25PSA2圓形,淺黃色,凸起,粗糙,有光澤,濕潤,不透明桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)10MSA7圓形,淺黃色,凸起,整齊,粗糙,有光澤,濕潤,不透明桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)0MSA5圓形,灰色,凸起,光滑,有光澤,濕潤,半透明,整齊短桿菌,無芽孢,無鞭毛,不運(yùn)動(dòng)0PSA5、4NA2圓形,淺黃色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明短桿菌,無芽孢,無鞭毛,不運(yùn)動(dòng)0MAC3、4NA9、10NA3、25NA9圓形,灰色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,不透明桿菌,無芽孢,單極鞭毛運(yùn)動(dòng)25MNA1擴(kuò)展,乳白色,凸起,不整齊,粗糙,濕潤,不透明桿菌,有芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)0PSA2、10NA6圓形,灰白色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,不透明短桿菌,無芽孢,周身鞭毛運(yùn)動(dòng)0MAC1圓形,乳白,扁平,粗糙,干燥,不透明桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng),0NA2擴(kuò)展,乳白色,扁平,不整齊,褶皺,無光澤,干燥,不透明桿狀,有芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)4PSA3、25PSA1圓形,黃色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明短桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)4NA5、10MAC4、圓形,乳白色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明桿菌,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)4MNA1圓形,淺黃色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明短桿菌,無芽孢,一根極生鞭毛運(yùn)動(dòng)4MNA4圓形,白色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,不透明桿狀,無芽孢,無鞭毛,不運(yùn)動(dòng)25NA6圓形,乳白色,凸起,整齊,光滑,無光澤,不透明球形,無芽孢,無鞭毛,不運(yùn)動(dòng)10PSA3、圓形,白色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明直桿狀,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)25MAC4圓形,淺黃色,凸起,整齊,光滑,有光澤,濕潤,半透明桿狀,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)10MRS0圓形,乳白色,凸起,粗糙,有光澤,濕潤,不透明桿菌,G-,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)25MAC1圓形,淺灰色,凸起,光滑,有光澤,濕潤,半透明短桿狀,無芽孢,周生鞭毛運(yùn)動(dòng)

表3　腐敗細(xì)菌菌株的部分生理生化實(shí)驗(yàn)

注：+，大多數(shù)(≥90%)菌株為陽性；-，大多數(shù)(≥90%)菌株為陰性；NT，未試驗(yàn)。

2.2腐敗細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定

所提取的鮮切生菜腐敗細(xì)菌的DNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，均得到重復(fù)性好且穩(wěn)定、清晰的特異條帶，片段大約1 500 bp左右。圖2為鮮切生菜0 ℃下腐敗細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖。PCR產(chǎn)物由擎科生物有限公司進(jìn)行測序。將得到的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性檢索和比對分析，獲得與其同源性較高的相似序列，使用MEGA5.1進(jìn)行序列比對，比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3、圖4、圖5和圖6。

圖2　鮮切生菜0 ℃下腐敗細(xì)菌PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2　Electrophoresis profiles of PCR produces of dominant spoilage bacteria at 0 ℃

圖3　基于0 ℃腐敗細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of spoilage bacteria at 0℃

圖4　基于4 ℃腐敗細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of spoilage bacteria at 4 ℃

圖5　基于10 ℃腐敗細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of spoilage bacteria at 10℃

圖6　基于25 ℃腐敗細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of spoilage bacteria at 25 ℃

由形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定最終確定鮮切生菜0 ℃貯藏條件下的腐敗細(xì)菌PSA4、MNA2、MSA5、PSA5、MAC3、PSA2、MAC1、NA2分別為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、費(fèi)氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、水拉恩菌(Rahnellaaquatilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfulva)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、居泉沙雷菌(Serratiafonticola)和假蕈狀芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoides)；鮮切生菜4 ℃貯藏條件下的腐敗細(xì)菌PSA2、NA2、NA9、PSA3、MNA1、NA5、MNA4分別為為成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、水拉恩菌(Rahnellaaquatilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfulva)、植物短小桿菌(Curtobacteriumplantarum)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)和乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)；鮮切生菜10 ℃貯藏條件下的腐敗細(xì)菌NA1+、MRS0、MSA7、NA3、NA6、MRS0+、MAC4、MAC5、PSA3分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacea)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfulva)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)、解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)和赫氏埃希菌(Escherichiahermannii)；鮮切生菜25 ℃貯藏條件下的腐敗細(xì)菌NA1+、MRS0、MSA7、NA3、NA6、MRS0+、MAC4、MAC5、MRS7、PSA3分別為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacea)貯藏條件下的腐敗細(xì)菌PSA1+、PSA2、NA9、PSA1、MAC4、NA6、MAC1、MNA1分別為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfulva)、植物短小桿菌(Curtobacteriumplantarum)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3　結(jié)論與討論

不同溫度貯藏條件下微生物菌相變化分析表明，水拉恩菌、泛菌、氣單胞菌、歐文氏菌、熒光假單胞菌等均為鮮切生菜貯藏過程中的腐敗菌，但不同溫度貯藏條件下的鮮切生菜共有的腐敗細(xì)菌為熒光假單胞菌。RANDAZZO等[15]研究報(bào)道了鮮切生菜優(yōu)勢腐敗細(xì)菌為熒光假單胞菌、成團(tuán)泛菌和水拉恩菌，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。但可能由于貯存條件及操作環(huán)境的不同，RANDAZZO等并沒有發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)檢測到的鮮切果蔬中比較常見的歐文氏菌，同時(shí)本研究未能發(fā)現(xiàn)其他研究者檢測到的微小桿菌和微球菌[13]。鮮切生菜在25 ℃貯藏時(shí)分離到常存在于肉及肉制品中的葡萄球菌，這也許與試驗(yàn)操作過程中交叉感染有關(guān)。本文對不同溫度貯藏條件下鮮切生菜腐敗細(xì)菌的確定可以強(qiáng)化鮮切生菜的質(zhì)量控制，幫助企業(yè)采取有效的加工工藝，為以后鮮切生菜的保鮮研究提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)也為鮮切生菜貨架期的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Isolation and identification of spoilage bacteria of fresh-cut lettuce at different temperatures

XU Xiao-xia,CHEN An-jun*,SANG Wei-na,DENG Wen-jin,ZHAO Jiang-xin,LI Jia-xin，LIU Xing-yan

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

With fresh-cut lettuce as experimental material, the spoilage bacteria under different storage temperature (0 ℃, 4 ℃, 10 ℃, 25 ℃) were isolated and purified at the end of shelf life, and then their corruptibility were verified by tie-back experiment. The species of the spoilage bacteria were determined by comparing the homogeneities between the isolated and purified strains and the incubated ones. By comparing the differences of colony morphology, thirty-two strains were isolated. The taxonomic status of the bacteria was confirmed by 16S rDNA sequences classification study and the species of the spoilage bacteria were identified through morphological, physiological and biochemical characteristics. The results showed that the microbial flora of fresh-cut lettuce stored at different temperatures was complicated. Compared with gram-positive bacterium such asBacillusspp., gram-negative bacteria were at the dominant position, includingPseudomonasspp.,Erwiniaspp.,Pantoeaspp.,Aeromonasspp.,Rahnellaspp., etc. The microbial flora analysis at different storage temperatures showed that Pseudomonas fluorescens was the common spoilage bacteria during the storage of fresh-cut lettuce.

fresh-cut lettuce; storage temperature; dominant spoilage bacteria; isolation; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601010

碩士研究生(陳安均副教授為通訊作者,E-mail：591919465@qq.com)。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)：鮮切果蔬的病原菌安全控制技術(shù)(2012AA101606-03)

2015-09-08，改回日期：2015-10-13