黃瓜資源對(duì)黃瓜綠斑駁病毒廣東分離物的抗性水平鑒定

湯亞飛， 何自福*， 佘小漫， 林毓娥， 藍(lán)國(guó)兵

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東 廣州 510640； 2廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640； 3廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640

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黃瓜資源對(duì)黃瓜綠斑駁病毒廣東分離物的抗性水平鑒定

湯亞飛1,2， 何自福1,2*， 佘小漫1， 林毓娥3， 藍(lán)國(guó)兵1

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東 廣州 510640；2廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；3廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640

【背景】黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是嚴(yán)重威脅葫蘆科作物生產(chǎn)的毀滅性病原之一，該病毒已入侵我國(guó)十多個(gè)省份，危害西瓜、黃瓜等作物并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。早在2009年廣東即發(fā)現(xiàn)CGMMV為害西瓜和黃瓜，但黃瓜等葫蘆科作物對(duì)其抗性情況尚不清楚?！痉椒ā坎捎萌斯C(jī)械摩擦接種方法，測(cè)定了14份黃瓜種質(zhì)資源對(duì)CGMMV廣東分離物的抗性水平?！窘Y(jié)果】從廣東葫蘆病樣中分離獲得CGMMV，該病毒分離物MP基因序列與國(guó)內(nèi)報(bào)道的各分離物同源率均在99%以上；14份黃瓜種質(zhì)資源對(duì)該病毒分離物均表現(xiàn)為感病?！窘Y(jié)論與意義】廣東主要黃瓜資源對(duì)CGMMV均表現(xiàn)為感病，這為我省防控該病毒病提供了科學(xué)依據(jù)，也為黃瓜抗病育種提供了指導(dǎo)。

黃瓜綠斑駁花葉病毒； 黃瓜種質(zhì)資源； 抗性水平

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus，CGMMV)是一種大小為300 nm×18 nm的直桿狀、正單鏈RNA病毒，屬蕪菁花葉病毒科Tymoviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus(Hollingsetal.,1975)。CGMMV極易通過(guò)汁液傳播，也是典型的種傳病毒，種子帶毒是其主要的遠(yuǎn)距離傳毒方式，也可通過(guò)嫁接、菟絲子傳播(馮蘭香等，2007)。該病毒自然寄主范圍較窄,主要包括黃瓜、西瓜、甜瓜、瓠子、南瓜、葫蘆、絲瓜、苦瓜等葫蘆科作物。田間癥狀表現(xiàn)為葉片斑駁、畸形、花葉、有綠色凸起、脈間黃化、葉脈呈綠帶狀，并伴隨植株矮化等，嚴(yán)重影響作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，是威脅葫蘆科作物生產(chǎn)的重要病毒之一(李小妮等，2009)。

Ainsworth(1935)首次報(bào)道在英國(guó)黃瓜上發(fā)生了CGMMV為害。目前，歐洲、亞洲、南美洲的20多個(gè)國(guó)家已有報(bào)道(陳京和李明福，2007)。在中國(guó)，Hseuetal.(1987)首次在中國(guó)臺(tái)灣的冬瓜、西瓜、甜瓜和黃瓜上分離鑒定出該病毒，表明該病毒正式入侵我國(guó)。隨后，在廣西(秦碧霞等，2005)、甘肅(李紅霞等，2007)、遼寧(陳紅運(yùn)等，2009)、北京(田永蕾等，2009)、廣東(李小妮等，2009)、山東(田永蕾等，2009；王云等，2014)、云南(吳鑫等，2010)、湖北(湯少云等，2011)、浙江(林燚等，2012)、湖南(趙慧茹等，2013)、江蘇(任春梅等，2013)、上海(胡亞萍等，2013)、海南(王峰等，2014)、山西(杜江等，2015)、貴州(王莉爽等，2015)等地的棚室保護(hù)地及大田栽培的瓜類(lèi)作物上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病毒。由于CGMMV已在我國(guó)部分地區(qū)造成大田瓜類(lèi)作物的毀滅性損失，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了第788號(hào)公告，將其確定為全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。

選育和種植抗病品種是防治植物病毒最有效、最經(jīng)濟(jì)的措施，而篩選抗病材料和抗病基因是該措施的前提。筆者在調(diào)查廣東CGMMV的發(fā)生與為害基礎(chǔ)上，通過(guò)人工接種評(píng)價(jià)了主要黃瓜種質(zhì)資源的抗性水平，以期為黃瓜抗病育種及CGMMV的綜合防控提供指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

病源材料：葫蘆病葉于2014年1月采自廣東省佛山市三水區(qū)瓜類(lèi)產(chǎn)區(qū)，病株主要表現(xiàn)為葉片嚴(yán)重花葉，有輕微泡狀凸起，田間發(fā)病率100%。

供試材料：14份黃瓜種質(zhì)資源由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2毒原的檢測(cè)、鑒定與分離

1.2.1血清學(xué)檢測(cè)取葫蘆病葉100 mg，按1 g∶10 mL加入0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)研磨，8000 r·min-1離心3 min，上清液為葫蘆病葉粗提液。參照董曉輝等(2009)的方法，用CMV、CGMMV單克隆抗體對(duì)葫蘆病葉粗提液進(jìn)行Dot-ELISA血清學(xué)檢測(cè)。CMV、CGMMV單克隆抗體由浙江大學(xué)謝艷教授惠贈(zèng)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)應(yīng)用RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)分別抽提葫蘆病樣葉片的總RNA，以提取的葫蘆病樣總RNA 4 μL作模板，用隨機(jī)引物(TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用CGMMV MP基因的特異引物CGMMV-F(5′-CCACGAGTTGTTTCCTAATGC TG-3′)和CGMMV-R(5′-TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小為870 bp，PCR產(chǎn)物在1%的凝膠電泳上檢測(cè)。PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序，DNAStar軟件(DNASTAR Inc，Madison，USA)對(duì)所獲得的基因序列進(jìn)行拼接，BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索，DNAStar的MegAlign進(jìn)行序列比較分析。

1.2.3毒原的分離將CGMMV葫蘆病樣人工摩擦接種到子葉期黃瓜上，接種后30 d，采集發(fā)病葉，應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)其再檢測(cè)與驗(yàn)證。

1.3抗病性鑒定

對(duì)上述經(jīng)過(guò)人工摩擦接種的子葉期的黃瓜苗進(jìn)行繁殖，用于抗病性測(cè)定。待黃瓜苗長(zhǎng)至子葉期，取繁殖的毒原病葉，按1 g病葉∶10 mL 0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(pH7.2)進(jìn)行研磨勻漿，用緩沖液再稀釋10倍后用于人工摩擦接種。每個(gè)處理40株，3次重復(fù)。接種后，每2周調(diào)查一次接種株的病情指數(shù)。接種后第8周，待各處理病株的病情基本穩(wěn)定，可根據(jù)此時(shí)的病情指數(shù)對(duì)待鑒定品種的抗病性水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)任何發(fā)病癥狀；1級(jí)，心葉明脈或輕花葉；3級(jí)，心葉及中部葉片花葉、斑駁；5級(jí)，多數(shù)葉片花葉，少數(shù)葉片畸形、產(chǎn)生泡狀凸起，植株輕度矮化；7級(jí)，重花葉，多數(shù)葉片產(chǎn)生濃綠泡狀凸起或葉脈綠帶、畸形、皺縮，植株矮化；9級(jí)，重花葉，葉片明顯畸形，植株嚴(yán)重矮化甚至死亡。

根據(jù)病情指數(shù)將參試材料的抗性水平分為5類(lèi)：免疫(I)，DI為0；高抗(HR)，0

運(yùn)用Excel對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1毒原的檢測(cè)、鑒定與分離

2.1.1病原血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果Dot-ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，采集的葫蘆疑似病樣葉組織粗提取液與CGMMV單克隆抗體反應(yīng)均為陽(yáng)性，而與CMV單克隆抗體反應(yīng)均為陰性，說(shuō)明該葫蘆病樣受到CGMMV的侵染。

2.1.2病原RT-PCR檢測(cè)結(jié)果利用CGMMV MP基因的特異引物CGMMV-F/CGMMV-R進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，從上述所有葫蘆疑似病樣的cDNA中均能擴(kuò)增到1條預(yù)期大小870 bp的特異片段，而健康葫蘆樣品中未擴(kuò)增出任何片段(圖1)。對(duì)PCR產(chǎn)物純化測(cè)序，在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離自廣東葫蘆病葉的CGMMV MP基因序列與中國(guó)其他地區(qū)報(bào)道的序列同源率均在99%以上，進(jìn)一步證實(shí)該葫蘆病樣受到CGMMV的侵染。

圖1　葫蘆病樣RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Detection result of the diseased cucurbit samples using RT-PCR M:2000 bp marker; 1～6: 葫蘆病樣; 7:健康葫蘆樣品。 M: 2000 bp marker; 1～6: Diseased samples; 7: Healthy sample.

2.1.3毒原的分離人工摩擦接種30 d后，黃瓜新出的真葉表現(xiàn)為花葉、有綠色泡狀凸起。RT-PCR檢測(cè)表明，這些接種發(fā)病的黃瓜樣品受到CGMMV的侵染，可作為CGMMV的毒原用于抗性評(píng)價(jià)。

2.2黃瓜種質(zhì)資源抗性鑒定結(jié)果

應(yīng)用人工摩擦接種方法將CGMMV廣東分離物分別接種到14份黃瓜上。接種后第8周，各處理病情基本穩(wěn)定，統(tǒng)計(jì)各處理的病情指數(shù)。結(jié)果顯示(表1)：G17的平均病情指數(shù)最高(100%)，YF的平均病情指數(shù)最低(71.54%)。方差分析顯示，YF與其余13份黃瓜種質(zhì)的病情指數(shù)差異達(dá)到極顯著水平；K13與其余12份黃瓜種質(zhì)的病情指數(shù)差異達(dá)到極顯著水平；A4*YF與G13、A8、B80、G13*G28、力豐及G17差異達(dá)到極顯著水平，與B35、N2、G6差異也達(dá)到顯著水平；82大與G13、A8、B80、G13*G28、力豐及G17差異達(dá)到極顯著水平，與G6差異達(dá)到顯著水平；A4與G17差異達(dá)到極顯著水平，與G13、A8、B80、G13*G28、力豐差異也達(dá)到顯著水平；其余種質(zhì)病情指數(shù)間差異均未達(dá)到顯著水平。雖然參試的14份黃瓜種質(zhì)的病情指數(shù)存在不同程度的差異，但這14份黃瓜種質(zhì)對(duì)CGMMV抗性水平均表現(xiàn)為感病。

3　討論

將分離自葫蘆病樣上的CGMMV廣東分離物，通過(guò)人工摩擦接種方式，評(píng)價(jià)14份黃瓜種質(zhì)的抗性水平。結(jié)果顯示，該病毒分離物對(duì)黃瓜具有強(qiáng)致病力，這些黃瓜均表現(xiàn)為感病，表明我省主要黃瓜育種資源缺乏抗CGMMV的材料，需要進(jìn)一步廣泛收集和篩選，以滿足黃瓜抗病新品種選育及CGMMV綜合防控要求。

對(duì)CGMMV廣東分離物的MP基因進(jìn)行克隆及序列分析，該序列與國(guó)內(nèi)報(bào)道的各分離物同源率高達(dá)99%以上，說(shuō)明侵染廣東葫蘆的病毒分離物是CGMMV的一個(gè)分離物。

自2005年首次在我國(guó)大陸報(bào)道發(fā)現(xiàn)CGMMV以來(lái)，全國(guó)有多個(gè)省份先后出現(xiàn)了CGMMV的疫情。吳元華等(2010)對(duì)CGMMV在我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)性進(jìn)行了分析，認(rèn)為CGMMV定殖、擴(kuò)散的可能性極高，屬于高度危險(xiǎn)性的有害生物。一旦瓜類(lèi)作物被侵染，則防治較為困難，做好該病害的預(yù)防和控制刻不容緩。培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效的預(yù)防和控制措施之一，而對(duì)種質(zhì)資源的抗病性進(jìn)行測(cè)定是培育抗病品種的前提和基礎(chǔ)。目前，國(guó)內(nèi)僅見(jiàn)到砧木與西瓜品種對(duì)CGMMV耐病性比較的報(bào)道(葉建人等，2015)，未見(jiàn)到其他葫蘆科作物對(duì)CGMMV抗性的相關(guān)報(bào)道。

表1　14份黃瓜種質(zhì)資源對(duì)CGMMV抗性水平鑒定結(jié)果Table 1　The resistance levels of 14 cucumber germplasms to cucumber green mottle virus

黃瓜是廣東省重要的蔬菜作物，目前正在遭受CGMMV的威脅。本文評(píng)價(jià)了收集到的14份黃瓜種質(zhì)資源對(duì)CGMMV的抗性水平，雖然這些資源的病情指數(shù)存在不同程度的差異，但對(duì)CGMMV均表現(xiàn)為感病，說(shuō)明我省主要黃瓜種質(zhì)資源中缺少抗CGMMV的資源。下一步將收集更多黃瓜種質(zhì)資源材料，評(píng)價(jià)其對(duì)CGMMV的抗病性，為黃瓜抗CGMMV育種提供抗源材料，也為我省CGMMV綜合防控提供指導(dǎo)。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

Identification of cucumber germplasm resistance toCucumbergreenmottlevirusGuangdong isolate

Ya-fei TANG1,2, Zi-fu HE1,2*, Xiao-man SHE1, Yu-e LIN3,Guo-bing LAN1

1PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640,China;2GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou,Guangdong510640,China;3VegetableResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640,China

【Background】Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV) is one of the most devastating pathogens of cucurbit crops. The virus has invaded more than ten provinces of China and infected crops such as watermelon and cucumber, causing serious economic losses. CGMMV infected watermelon and cucumber in Guangdong Province in 2009, but the resistance of cucumber and other cucurbits was unknomn. 【Method】 The resistance of 14 cucumber germplasms to a CGMMV isolate was tested using artificial mechanical inoculation and nucleotide sequencing. 【Result】 The MP nucleotide sequence of CGMMV of Guangdong isolate from the diseased cucurbit samples was 99% similar to other isolates of CGMMV collected in China. All of 14 cucumber germplasms were susceptible to the isolate of CGMMV. 【Conclusion and significance】 The main cucumber germplasms from Guangdong are not resistant to CGMMV. This result provides a scientific basis for control of CGMMV, and some guidance for cucumber breeding to resist CGMMV in Guangdong.

Cucumbergreenmottlemosaicvirus； cucumber germplasm； resistance levels

2016-05-11接受日期(Accepted)： 2016-06-27

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303028)； 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B070706017、2014B020202004)

湯亞飛， 女， 碩士研究生。 研究方向: 植物病毒。 E-mail: yf.tang1314@163.com

Author for correspondence), E-mail: hezf@gdppri.com

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.03.010