利用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記定位玉米葉夾角主效QTL

張沁斌，秦永田，許蒙蒙，陳永強(qiáng)，李衛(wèi)華，付志遠(yuǎn)

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 45002；2. 河南省鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河南 鶴壁 456284)

利用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記定位玉米葉夾角主效QTL

張沁斌1，秦永田2，許蒙蒙1，陳永強(qiáng)1，李衛(wèi)華1，付志遠(yuǎn)1

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 45002；2. 河南省鶴壁市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河南 鶴壁 456284)

對(duì)EMS誘變獲得的平展葉夾角突變體M 87-1的遺傳規(guī)律進(jìn)行了標(biāo)記分析。結(jié)果表明，在豫82背景影響下，M 87-1與豫82組配的分離群體的葉夾角表現(xiàn)典型的數(shù)量性狀遺傳。在3 072個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)標(biāo)記中，共檢測(cè)到1 254個(gè)SNPs在雙親間存在多態(tài)性。通過簡(jiǎn)化的數(shù)量性狀位點(diǎn)(Quantitative trait locus, QTLs)分析方法，對(duì)BC1((豫82×M 87-1)×M 87-1)分離群體的葉夾角性狀進(jìn)行遺傳定位，共檢測(cè)到3個(gè)主效QTLs，分別位于第1, 2, 7染色體上，其中位于第7染色體上的QTL與葉夾角表型擬合程度最高，可能包含EMS誘變的突變位點(diǎn)。

玉米；葉夾角；主效QTL；單核苷酸多態(tài)性

隨著飼料加工業(yè)的發(fā)展和種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，中國玉米長(zhǎng)期自給有余的現(xiàn)狀在2010年出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，成為玉米凈進(jìn)口國。在耕地資源日益減少的情況下，依靠單位面積產(chǎn)量的提高來增加總產(chǎn)已成為中國現(xiàn)階段玉米育種的主要目標(biāo)[1-2]。單位面積產(chǎn)量的提高以群體光合效率的增強(qiáng)、抗耐倒伏和逆境能力的提高為基礎(chǔ)。葉夾角是玉米株型育種中的重要性狀之一，葉夾角小的株型能提升種植密度，增強(qiáng)光合性能。因此，定位和克隆控制玉米葉夾角性狀的QTLs，解析玉米株型性狀分子生物學(xué)機(jī)制，對(duì)促進(jìn)耐密型高產(chǎn)玉米新品種選育和相關(guān)分子標(biāo)記輔助選擇育種具有重要理論和實(shí)踐意義。盡管葉夾角性狀是株型育種的重要參考指標(biāo)，但是相應(yīng)QTL的定位和克隆研究很少。目前僅有少數(shù)幾篇關(guān)于玉米葉夾角QTL定位與分析的報(bào)道，且這些研究多是利用SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳分析和定位[3-8]。該方法得到的定位區(qū)間大，進(jìn)一步精細(xì)定位所需要的多態(tài)性SSR標(biāo)記較難開發(fā)。與SSR標(biāo)記相比，SNP標(biāo)記數(shù)量多，在基因組中的分布密度很高，更適合于對(duì)數(shù)量性狀的遺傳解剖以及基于群體的基因定位和克隆研究。而且轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)的SNP標(biāo)記多為基因內(nèi)標(biāo)記，有助于更快實(shí)現(xiàn)候選基因的精細(xì)定位。TIAN等[9]通過全基因組關(guān)聯(lián)方法對(duì)玉米葉夾角相關(guān)QTL進(jìn)行定位分析，是目前僅有的1篇用SNPs獲得葉夾角主效QTL的文章。通過EMS誘變研究，獲得了一個(gè)葉夾角基本趨于平展的突變體M 87-1，為解析其突變位點(diǎn)，與87-1組配了F2和BC1群體。F1葉夾角表現(xiàn)與87-1接近，F(xiàn)2(720株)和BC1(630株)群體表現(xiàn)單隱性基因控制的性狀遺傳分離規(guī)律。但由于EMS誘變導(dǎo)致的突變多為單堿基突變，在有限的分離群體中未篩選到與葉夾角性狀緊密連鎖的SSR標(biāo)記。進(jìn)一步利用M 87-1與緊湊株型自交系豫82構(gòu)建了BC1分離群體，在豫82背景影響下，葉夾角性狀的分離表現(xiàn)典型的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。本研究利用SNPs標(biāo)記對(duì)該分離群體的葉夾角性狀進(jìn)行遺傳分析，鑒定控制葉夾角性狀的主效QTLs，為葉夾角相應(yīng)基因的克隆奠定基礎(chǔ)，為合理株型育種提供可用的基因和標(biāo)記信息。

1 材料與方法

1.1供試材料

2013年夏以87-1為材料，通過EMS誘變獲得了葉夾角突變體M 87-1(圖1)。2013年冬于海南組配了2個(gè)雜交組合F1(87-1×M 87-1和豫82×M 87-1)。2014年夏于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)組配了87-1為背景的F2(720株)和BC1(630株)分離群體及豫82為背景的BC1分離群體(540株)。

1.2田間試驗(yàn)

分離群體及親本材料于2015年夏分別種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)和長(zhǎng)葛市，田間采取完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，行距0.67 m，株距0.22 m，每行20株。

1.3性狀調(diào)查

在植株授粉后15 d對(duì)單株穗部葉及穗上和穗下第1片葉與莖的夾角進(jìn)行測(cè)定。親本及F1各選取有代表性的20株，分別測(cè)量單株的穗位葉、穗位上和穗位下第1葉葉夾角，并以相應(yīng)的平均值代表各自的葉夾角。

1.4標(biāo)記分析及連鎖作圖

采用CTAB法提取BC1單株及雙親DNA(幼嫩葉片)，并用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記分析。3 072個(gè)均勻分布于玉米10條染色體的SNP標(biāo)記用于檢測(cè)雙親的核苷酸多態(tài)性。BC1分離群體中兩種極端類型個(gè)體(93株)用于親本間有多態(tài)性的SNP標(biāo)記分析。SNP標(biāo)記的統(tǒng)計(jì)分析在Genome studio data分析軟件(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)中進(jìn)行。連鎖遺傳分析和主效QTL定位同時(shí)采用JoinMap 4.0軟件的最大釋然估計(jì)算法[10]和fisher獨(dú)立性測(cè)驗(yàn)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1棒三葉葉夾角的表型變異分析

87-1，M 87-1，豫82及雜種F1(豫82×M 87-1)的穗位葉葉夾角普遍較穗上葉葉夾角和穗下葉葉夾角大(表1)。EMS誘變得到的M 87-1突變體的棒三葉葉夾角與87-1有顯著變異，且變異倍數(shù)都在2倍以上，較緊湊株型自交系豫82的棒三葉葉夾角變異倍數(shù)高達(dá)3倍以上，且2個(gè)地點(diǎn)間棒三葉葉夾角的變化趨勢(shì)一致。可見，M 87-1與豫82組配群體較M 87-1與 87-1組配群體能夠獲得更豐富的葉夾角表型變異。豫82與M 87-1的雜交種的棒三葉葉夾角均介于低親和雙親平均值之間，說明棒三葉葉夾角性狀表現(xiàn)出負(fù)的中親優(yōu)勢(shì)。以上結(jié)果表明，緊湊株型玉米品種在株型改良方面有較大利用價(jià)值，可以在很大程度上減小棒三葉葉夾角，改良特定自交系的株型，改善其光合性能。

對(duì)BC1分離群體的棒三葉葉夾角進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，棒三葉葉夾角在基因型間均達(dá)到極顯著水平(表2)，2個(gè)親本自交系的棒三葉葉夾角在不同地點(diǎn)間的差異都不顯著，雜交組合僅穗下葉葉夾角在不同地點(diǎn)間存在極顯著差異。以上結(jié)果說明，基因型間的差異是棒三葉葉夾角差異顯著性的主要原因。

表1 親本及F1棒三葉葉夾角分析Table 1 Leaf angle analysis of the trefoil angel bar in parental lines and F1

表2 BC1群體棒三葉葉夾角的方差分析Table 2 Combined analysis of variance of the trefoil angel bar leaf angle

注：***為0.001顯著水平;a為P值.

Note: *** means significant level at 0.001;ameansPvalue.

2.2BC1群體葉夾角性狀的SNP分析

為定位葉夾角性狀的主效基因，研究采用了簡(jiǎn)化QTL定位方法，僅選擇群體中的兩種極端葉夾角類型個(gè)體進(jìn)行遺傳分析。極端類型個(gè)體共有93株，46株葉夾角極小，47株葉夾角極大。3 072個(gè)SNP標(biāo)記中，剔除缺失率大于20%的標(biāo)記和親本是雜合的標(biāo)記，共檢測(cè)到1 254個(gè)在親本間有多態(tài)性的標(biāo)記。用多態(tài)性SNPs的分布頻數(shù)和極端葉夾角表型個(gè)體的理論分布頻數(shù)做Fisher獨(dú)立性測(cè)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在玉米第1, 2, 7條染色體上存在葉夾角的主效QTL，qLA1,qLA2和qLA7。qLA1與SNP標(biāo)記SYN35048和PZE-101205714緊密連鎖，qLA2與SNP標(biāo)記PZE-102013873和PZE-102017304緊密連鎖，qLA7與SNP標(biāo)記SYN19272和 PZE-107074405緊密連鎖(圖1)。將極端類型個(gè)體表型對(duì)應(yīng)的基因型作為標(biāo)記信息，用joinmap軟件得到了類似的結(jié)果，qLA1與鄰近標(biāo)記的遺傳距離最遠(yuǎn)，qLA2與鄰近標(biāo)記的遺傳距離次之，qLA7與鄰近標(biāo)記的遺傳距離最近。

圖1 多態(tài)性SNPs與葉夾角表型間的fisher獨(dú)立測(cè)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of fisher test between polymorphic markers and leaf angle

3 結(jié)論與討論

葉夾角是玉米合理株型育種中的重要參考指標(biāo)。緊湊上沖型玉米品種通常種植密度高，葉面向上挺拔，有利于降低玉米群體遮蔭綜合征，提高光合效率。前人對(duì)玉米葉夾角遺傳規(guī)律進(jìn)行了較為深入的研究，認(rèn)為葉夾角性狀的遺傳力高，在遺傳中同時(shí)受基因的加性效應(yīng)和非加性效應(yīng)的影響，但加性效應(yīng)在遺傳中占主導(dǎo)地位。因此，可以通過有利等位基因的標(biāo)記篩選和聚合獲得合理株型種質(zhì)資源，為玉米株型育種提供有利玉米株型的自交系。

基于葉夾角性狀在株型育種中的重要性，多位學(xué)者利用不同的群體和方法對(duì)控制葉夾角性狀的基因進(jìn)行了遺傳定位分析。MICKELSON等[3]利用B 73×Mo 17的重組自交系群體，采用復(fù)合區(qū)間作圖法，2個(gè)環(huán)境共檢測(cè)到9個(gè)控制葉夾角的QTL，分別位于第1, 2, 4, 5和7染色體，其中qLA7(第7染色體)可以解釋27.7%的葉夾角表型變異，是一個(gè)主效QTL。TIAN等[9]以B 73為母本，以25個(gè)自交系為父本構(gòu)建的25個(gè)重組自交系群為材料采用GWAS方法對(duì)葉夾角進(jìn)行QTL定位，共定位到30個(gè)主效QTL，分布于10條染色體上。于永濤等[4]以3個(gè)F2群體(H 21×M o17, 自330×K 36, B 73×L 050)及其衍生的3個(gè)F2:3家系為材料，利用區(qū)間作圖法，定位到9個(gè)控制葉夾角的QTL，分別位于第1, 2, 3, 8, 9和10染色體上。路明等[5]以掖478×丹340的F2為群體，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，共定位到6個(gè)控制葉夾角的QTL，分別位于第1, 2, 3和5染色體上，位于第1和第3染色體上的主效QTL可以分別解釋10.8%和11.2%的葉夾角表型變異。KU等[6]利用豫82與沈137、豫87-1、D 132構(gòu)建的3套F2群體及相應(yīng)的F2:3家系為材料，共檢測(cè)到14個(gè)葉夾角QTLs，分別位于第1, 2, 3, 4, 5, 7, 8和9染色體上。KU等[7]通過精細(xì)定位克隆了位于第1染色體上的qTAC1。ZHANG等[8]通過精細(xì)定位克隆了位于第4染色體上的主效qLAC4-1。本研究利用EMS誘變得到的葉夾角突變體與豫82(回交親本)構(gòu)建的BC1群體為材料，通過簡(jiǎn)化QTL定位方法，同時(shí)利用fisher測(cè)驗(yàn)和Jionmap作圖，鑒定的3個(gè)主效QTLs中，qLA7將是葉夾角主效基因克隆的一個(gè)關(guān)鍵QTL。本研究利用的是分布于全基因的SNPs標(biāo)記，較前人研究中所用的SSR標(biāo)記更有助于明確QTL區(qū)間內(nèi)相應(yīng)的基因信息。

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(責(zé)任編輯：常思敏)

Geneticanalysisforleafangleinmaize

ZHANG Qinbin1, QIN Yongtian2, XU Mengmeng1, CHEN Yongqiang1, LI Weihua1, FU Zhiyuan1

(1. College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002，China; 2. Hebi Agricultural Science Institute, Hebi 456284, China)

The marker analysis of genetic rule was conducted for leaf angle mutant of M 87-1 derived from EMS mutagenesis. The results showed that the leaf angle was quantitatively controlled under the genetic background of Yu 82. 1 254 of the 3 072 SNPs were polymorphic between the two parental lines M 87-1 and Yu 82. Three major QTLs were detected on chromosome 1, 2, and 7 in BC1population by simplified QTL analysis, respectively. The degree of fitting between QTL and leaf angle was the best for QTL on chromosome 7. And this QTL might contain the EMS mutation site in M 87-1.

maize; leaf angle; major quantitative trait locus; single nucleotide polymorphism

S 513

：A

2015-09-28

省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(SKL2014ZH-09)

張沁斌(1990-)，男，河南鶴壁人，碩士研究生，主要從事玉米遺傳育種研究。

付志遠(yuǎn)(1980-)，女，河南安陽人，副教授，博士。

1000-2340(2016)02-0157-04