澳大利亞厚皮海綿化學(xué)成分分離鑒定及其抗腫瘤活性研究

宋淑梅，鄭亞旭，佟長青，李偉

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023）

SONG Shu-mei，ZHENG Ya-xu，TONG Chang-qing，LI Wei

（College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

澳大利亞厚皮海綿化學(xué)成分分離鑒定及其抗腫瘤活性研究

宋淑梅，鄭亞旭，佟長青，李偉

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116023）

為進(jìn)一步探求澳大利亞厚皮海綿Craniella australiensis在海洋藥物研制中的作用，采用硅膠柱層析及Sephadex LH-20凝膠過濾層析等技術(shù)，從澳大利亞厚皮海綿乙酸乙酯層浸膏中分離純化出兩種化合物，并通過波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照的方法對化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，采用CCK-8法對2個(gè)化合物進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞活性試驗(yàn)。結(jié)果表明：從澳大利亞厚皮海綿分離得到的2個(gè)化合物分別為Aldisin和2-Bromoaldisin；體外抗腫瘤細(xì)胞活性試驗(yàn)顯示，化合物Aldisin和2-Bromoaldisin對人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞 （Caco-2）、人結(jié)腸癌細(xì)胞 （HCT116）、人肝癌細(xì)胞 （7721）、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 （U251）和人腎癌細(xì)胞 （A498）均具有抑制活性的作用，其中化合物Aldisin處理7721細(xì)胞的IC50為 （67.56±3.06）μg/mL，抑制作用顯著。研究表明，兩種化合物屬于天然產(chǎn)物，可作為潛在的抗腫瘤藥物進(jìn)行進(jìn)一步研究。

澳大利亞厚皮海綿；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定；體外抗腫瘤

海綿是最原始的多細(xì)胞動(dòng)物，隸屬于多孔動(dòng)物門，迄今已發(fā)現(xiàn)約15 000種，從潮間帶到幾千米深的海域均有分布。海綿種類繁多，可生長于高溫（或低溫）、高鹽、高壓、缺氧、少光的環(huán)境中，因而具有特殊的代謝途徑。又由于海綿與微生物共生，復(fù)雜的生長狀態(tài)使其代謝物和次生代謝物極為豐富［1］。從海綿中已分離出多種化合物，包括生物堿類、甾體類、聚酮類、大環(huán)內(nèi)酯、環(huán)肽和過氧化物類等，這些化合物往往具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抑制酶和抗人類心血管疾病等活性［2-3］。因此，海綿是目前發(fā)現(xiàn)新物質(zhì)最多的海洋動(dòng)物之一，是海洋天然產(chǎn)物的最大來源［4-6］。如從 Halicortex sp.中可得到一種新的溴吲哚生物堿Dragmacidin F，它具有抗HSV-1和HIV-1的活性［7-8］。另有研究表明，從Dysidea sp.中得到兩個(gè)倍半萜環(huán)戊烯酮Dysidenones A、B及一個(gè)倍半萜氨基醌Dysidine，Dysidenones A、B的混合物和Dysidine在濃度為10 μg/mL時(shí)就能顯著抑制人滑膜磷脂酶PLA2［9］。日本學(xué)者從Theonella sp.中分離得到3個(gè)含硫含氮的大環(huán)內(nèi)酯Theonezolide A～C，它們都是由兩個(gè)含有多種官能團(tuán) （烷氧基、噻唑環(huán)、硫酸酯、酰胺鍵）的脂肪酸鏈組成的37元環(huán)內(nèi)酯，這3種化合物均對小鼠L1210淋巴瘤細(xì)胞和KB人表皮癌細(xì)胞具有顯著抑制活性［10-11］。 饒志剛等［12］從南海海綿Rhabdastrella乙酸乙酯層浸膏中分離得到一個(gè)具有新型側(cè)鏈的膽甾醇。

澳大利亞厚皮海綿Craniella australiensis隸屬于尋常海綿綱Demospongiae、旋骨海綿目Spirophorida、茄海綿科 Tetillidae、厚皮海綿屬 Craniella。雖然李斌［13］從澳大利亞海綿甲醇提取物中分離純化得到苯丙氨酸、腺嘌呤、多種甾類、鄰苯二甲酸二甲酯和罕見的奇數(shù)碳脂肪酸甲酯類化合物，但總體來講對澳大利亞厚皮海綿天然產(chǎn)物的報(bào)道較少。本研究中，對澳大利亞厚皮海綿化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，并對得到的化合物進(jìn)行抗腫瘤活性研究，旨在為澳大利亞厚皮海綿的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

澳大利亞厚皮海綿由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所提供。硅膠G與GF254購自青島海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠購于Sigma公司；CCK-8檢測試劑盒 （Dojindo，CK04）購于上海銳賽生物技術(shù)有限公司；用于核磁的試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞 （Caco-2）、人結(jié)腸癌細(xì)胞 （HCT116）、人肝癌細(xì)胞 （7721）、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 （U251）、人腎癌細(xì)胞 （A498）由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；Caco-2細(xì)胞、7721細(xì)胞、U251細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%P/S+1% Gln；HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)基為1640+10%FBS+1% P/S+1%Gln；A498細(xì)胞的培養(yǎng)基為MEM+10% FBS+1%P/S+1%Gln。

1.2方法

1.2.1澳大利亞厚皮海綿浸膏的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［14］中的方法，并稍作修改。具體過程如下：取2.5 kg新鮮澳大利亞厚皮海綿，剪成1 cm3的小塊，加入3倍體積的75%乙醇回流熱浸提2 h，濾出提取液，殘?jiān)^續(xù)加3倍體積的75%乙醇提取，重復(fù)3次，合并提取液。提取液在4℃下以6000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液減壓濃縮、冷凍干燥，得總浸膏123 g。

將總浸膏依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次。將萃取液減壓濃縮、自然風(fēng)干，得到石油醚層浸膏 （2 g）、乙酸乙酯層浸膏 （12 g）和正丁醇層浸膏 （22 g）。

1.2.2澳大利亞厚皮海綿化學(xué)成分的分離純化

通過TLC薄層色譜層析，確定乙酸乙酯層浸膏的洗脫體系為二氯甲烷-甲醇體系。取乙酸乙酯層浸膏5 g，溶解于適量二氯甲烷中，然后將其滴加到5.5 g硅膠 （300～400目）中，攪拌使樣品與硅膠充分吸附，靜置，將石油醚揮干備用。

稱取硅膠 （300～400目）40 g，濕法裝柱后用二氯甲烷進(jìn)行洗脫平衡，將上述揮發(fā)完全的拌樣硅膠均勻加入到空白硅膠上層，用二氯甲烷-甲醇體系 （100∶0～0∶100）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫5個(gè)柱體積，分別收集并濃縮除去洗脫液。通過薄層層析進(jìn)行跟蹤分析，合并相似組分，得到E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6等6個(gè)組分。

組分E-2繼續(xù)運(yùn)用柱層析分離，用二氯甲烷-氯仿體系 （100∶0～10∶1）梯度洗脫，得到E2-1、E2-2、E2-3等3個(gè)亞組分。亞組分E2-1重結(jié)晶得到化合物1（39 mg）；亞組分E2-3反復(fù)通過Sephadex LH-20凝膠過濾層析分離，甲醇洗脫，得到化合物2（3 mg）。

1.2.3化合物結(jié)構(gòu)鑒定 采用核磁共振光譜（NMR）對化合物進(jìn)行鑒定。NMR通過 Bruker Avance DRX 600核磁共振儀 （600/150 MHz）獲得，以四甲基硅烷 （TMS）作內(nèi)標(biāo)。

1.2.4化合物體外抗腫瘤活性測定 采用CCK-8法對Caco-2、HCT116、7721、U251、A498腫瘤細(xì)胞進(jìn)行化合物體外抗腫瘤試驗(yàn)。

以DMSO溶解化合物1，以丙酮溶解化合物2，分別配制成10 mg/mL母液，備用。

將腫瘤細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中 （7721、A498細(xì)胞：8×103cells/孔，HCT116細(xì)胞：1×104cells/孔，Caco-2、U251細(xì)胞：5×103cells/孔），在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)；將樣品母液加入培養(yǎng)板孔中，使其最終濃度分別為0、2、20、200、1000 μg/mL。藥物處理36 h后，取樣觀察細(xì)胞形態(tài)，然后每孔加入10 μL CCK-8，混勻后再培養(yǎng)2 h，測定450 nm處的吸光值。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 澳大利亞厚皮海綿中的化合物結(jié)構(gòu)

化合物1：白色粉末，熔點(diǎn)為254～256℃。1H NMR［600 MHz，（CD3）2SO］：δ 2.70～2.72（m，2H），6.56～6.57（t，2H），6.98～6.99（t，2H），8.31（t，1H），12.15（s，1H）。13C NMR［150 MHz，（CD3）2SO］：δ 36.58，43.52，109.57，122.38，123.60，127.9，162.26，194.40。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［15］報(bào)道的Aldisin一致，由此確定，化合物1為Aldisin，分子式為C8H8N2O2。

化合物2：黃色針狀晶體，熔點(diǎn)為232～234℃。1H NMR［600 MHz，（CD3）2CO］：δ 3.55～3.58（m，2H），6.64～6.67（m，2H），7.06～7.07（t，1H），7.60（s，1H），11.78（s，1H）。13C NMR［150 MHz，（CD3）2CO］：δ 37.81，44.28，105.62，112.64，126.00，130.25，162.36，193.62。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［15］報(bào)道的2-Bromoaldisin基本一致，由此確定，化合物2為2-Bromoaldisin，分子式為C8H7N2O2Br。

圖1　化合物1、2的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of compounds 1 and 2

2.2體外抗腫瘤活性測定

利用CCK-8法研究化合物Aldisin和2-Bromoaldisin對 5種腫瘤細(xì)胞 （Caco-2、HCT116、7721、U251、A498細(xì)胞）的生長抑制作用。由圖2可知，化合物 Aldisin對 Caco-2、HCT116、7721、U251、A498細(xì)胞的抑制作用均隨著化合物濃度的升高而增強(qiáng)，具有劑量依賴性。當(dāng)化合物濃度降低至2、20 μg/mL時(shí)，Aldisin對5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用比較弱，抑制率≤10%；但當(dāng)濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，抑制作用急劇增強(qiáng)，抑制率高達(dá)50%～78%；當(dāng)濃度增加到1000 μg/mL時(shí)，Aldisin對5種腫瘤細(xì)胞的抑制率均高達(dá)90%以上，其中對A498的抑制率最大，為92.43%。

圖2　Aldisin對5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用Fig.2 Inhibitory activity of Aldisin on five tumor cells

由圖3可知，除2 μg/mL化合物2-Bromoaldisin處理的HCT116細(xì)胞及2、20 μg/mL該化合物處理的U251細(xì)胞外，其余濃度的化合物2-Bromoaldisin對Caco-2、HCT116、7721、U251、A498細(xì)胞的抑制作用均隨樣品濃度的升高而增強(qiáng)，具有劑量依賴性。低濃度的2-Bromoaldisin對5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用均較弱，抑制率≤15%；但當(dāng)濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，該化合物抑制作用急劇增強(qiáng)，抑制率達(dá)42%～69%；當(dāng)濃度增加到1000 μg/mL時(shí)，其對HCT116、7721、A498細(xì)胞的抑制率均高達(dá)90%，其中對 A498細(xì)胞的抑制率最大，為92.15%。

兩種化合物對5種腫瘤細(xì)胞的IC50值見表1。從表1可見，Aldisin和2-Bromoaldisin在對5種腫瘤細(xì)胞作用36 h后，其生長均受到不同程度的抑制，且不同的腫瘤細(xì)胞株對化合物的敏感性不同。其中 Aldisin對 7721細(xì)胞的 IC50值最小，僅為（67.56±3.06）μg/mL，說明Aldisin對7721細(xì)胞的抑制效果最顯著；除此之外，化合物Aldisin及2-Bromoaldisin對HCT116、7721、U251、A498細(xì)胞的IC50值為96～176 μg/mL，說明兩種化合物對相對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞均具有明顯的抑制效果，而兩種化合物對Caco-2細(xì)胞的抑制效果均較弱。

圖3　2-Bromoaldisin對5種腫瘤細(xì)胞的抑制作用Fig.3 Inhibitory activity of 2-Bromoaldisin on five tumor cells

表1　Aldisin和2-Bromoaldisin對5種腫瘤細(xì)胞的IC50值Tab.1 The inhibitory IC50values of Aldisin and 2-Bromoaldisin on five tumor cells　μg/mL

圖4為化合物Aldisin、2-Bromoaldisin分別在0、200 μg/mL濃度下處理 Caco-2、HCT116、7721、U251和A498細(xì)胞36 h后的細(xì)胞形態(tài)圖。通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，濃度為200 μg/mL的化合物處理細(xì)胞36 h后，細(xì)胞凋亡嚴(yán)重、數(shù)量明顯減少，并呈破碎狀，細(xì)胞形態(tài)完整性大幅下降。

圖4　Aldisin、2-Bromoaldisin處理5種腫瘤細(xì)胞36 h后的細(xì)胞形態(tài) （10×）Fig.4 The morphology of the five tumor cells treated with Aldisin and 2-Bromoaldisin for 36 h（10×）

3　討論

根據(jù)物質(zhì)的相似相溶原理可進(jìn)行生物活性物質(zhì)的提取，從生物體內(nèi)分離出的脂溶性物質(zhì)、水溶性物質(zhì)和醇溶性物質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)過具有抑制腫瘤細(xì)胞生長活性的化合物，例如生物堿、甾體化合物和多酚類等小分子類化合物，以及蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子類化合物。從澳大利亞厚皮海綿的乙酸乙酯層浸膏分離純化得到了Aldisin和2-Bromoaldisin兩個(gè)化合物。Aldisin是吡咯烷型生物堿，2-Bromoaldisin是溴代吡咯烷型生物堿，它們均是首次在該屬海綿中被發(fā)現(xiàn)。1985年，這兩個(gè)化合物于關(guān)島海綿中第一次被發(fā)現(xiàn)。從海綿Spongiaobligue和從未定名豆莢軟珊瑚Lobophytum sp.的乙酸乙酯萃取物中也分離純化得到過這兩個(gè)化合物［16-17］。唐孝禮等［18］從海綿Polymistia spongia分離純化得到Aldisin，并對它的抗脂質(zhì)過氧化及清除自由基作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Aldisin具有顯著的脂質(zhì)過氧化作用，并具有有效清除·、·OH和DPPH·的能力。但這兩個(gè)化合物的抗腫瘤活性尚未見報(bào)道。

CCK-8法是一種使用方便、檢測快速、靈敏度高、重復(fù)性好且對細(xì)胞毒性小的檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性的方法。本研究中，通過CCK-8法研究了Aldisin和2-Bromoaldisin對Caco-2、HCT116、7721、U251、A498細(xì)胞的生長抑制情況，發(fā)現(xiàn)這兩種化合物對5種腫瘤細(xì)胞均具有不同程度的抑制作用，且具有濃度依賴性。體外抗腫瘤IC50值結(jié)果顯示，除A498細(xì)胞外，化合物Aldisin對Caco-2、HCT116、7721、U251細(xì)胞的抑制活性均比化合物2-Bromoaldisin強(qiáng)，而兩個(gè)化合物在結(jié)構(gòu)上的差別僅僅是化合物2-Bromoaldisin是化合物Aldisin在C-8發(fā)生溴取代的產(chǎn)物。這個(gè)結(jié)論與劉洋等［19］得到的在苯環(huán)上引入強(qiáng)給電子取代基 （如Br、F等）可增強(qiáng)化合物的抗腫瘤活性正好相反，這可能是取代的位置不同所造成的。蘇麗［20］利用Aldisin為底物誘導(dǎo)合成2-Bromoaldisin，并對它們的細(xì)胞外PTP1B抑制活性進(jìn)行了研究，得出100 μmol/L的Aldisin和2-Bromoaldisin的抑制率分別為43.4%和4.7%，Aldisin的2位被Br取代后得到的化合物活性降低了90%，與本研究結(jié)果一致。但該類化合物的抗腫瘤機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

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Isolation，identification and anti-tumor activity of constituents from sponge Craniella australiensis

Two compounds were isolated from sponge Craniella australiensis by column chromatography on silica gel and gel filtration chromatography，and identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry property to evaluate the application of the sponge in preparation of marine drugs.The inhibition on tumor cells of both extracts from the sponge was evaluated by CCK-8 assay.The results showed that the two compounds were identified as Aldisin and 2-Bromoaldisin which exhibited the potent inhibitory activities against Caco-2，HCT116，7721，U251 and A495 cells in human.The Aldisin showed the strongest cytotoxic activity against 7221 cell with IC50（67.56±3.06）μg/mL.The findings indicate that the extracts as natural products are considered as a potential anti-tumor candidate for further study.

Craniella australiensis；constituent；structural identification；anti-tumor activity

SONG Shu-mei，ZHENG Ya-xu，TONG Chang-qing，LI Wei

（College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

TS254.1；R284

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.013

2095-1388（2016）04-0426-05

2015-10-28

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng) （201205022-7）；大連海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

宋淑梅 （1988—），女，碩士研究生。E-mail：294435745@qq.com

佟長青 （1976—），男，博士，副教授。E-mail：changqingtong@dlou.edu.cn；

李偉 （1964—），男，博士，教授。E-mail：aisingioro@hotmail.com