微小核糖核酸-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達的調(diào)節(jié)及其對血管內(nèi)皮細胞管腔形成的影響

陳偉，莫國君，羅雪蘭，王輝，楊鵬，歐和生

基礎(chǔ)與實驗研究

微小核糖核酸-24對內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因表達的調(diào)節(jié)及其對血管內(nèi)皮細胞管腔形成的影響

陳偉，莫國君，羅雪蘭，王輝，楊鵬，歐和生

目的：探討微小核糖核酸（microRNA）-24（miR-24）對內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表達調(diào)節(jié)的分子機制及其對血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響。

方法：構(gòu)建miR-24及其反義序列的高表達質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將實驗細胞分為：miR-24高表達組、miR-24 干擾組和空白質(zhì)粒對照組。用四甲基偶氮唑鹽（MTT）檢測HUVECs增殖能力，劃痕和Transwell試驗檢測細胞的遷移能力，人工基底膜檢測細胞的管腔形成能力；分別用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測eNOS和Sp1轉(zhuǎn)錄因子mRNA和蛋白表達水平。

結(jié)果：（1）與空白質(zhì)粒對照組比較，miR-24高表達組細胞增殖能力降低45.45%（0.36 ± 0.04 vs 0.66 ± 0.08，P＜0.05）；miR-24高表達組細胞遷移速度明顯減緩，且遷移數(shù)目降低74.75%（30.25±3.78 vs 119.80±10.94，P＜0.01），未能形成明顯管腔樣結(jié)構(gòu)。（2）與空白質(zhì)粒對照組比，miR-24高表達組eNOS mRNA降低46.2%（0.49±0.02 vs 0.91±0.01，P＜0.05），蛋白表達減少49.07%（0.55±0.05 vs 1.08±0.05，P＜0.05）；同時Sp1 mRNA降低44.9%（0.49±0. 01 vs 0. 89±0.02，P＜0.05），其蛋白質(zhì)表達量也相應(yīng)減少54.90%（0.46±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）。在miR-24抑制組中，上述指標(biāo)較空白質(zhì)粒對照組降低，但比miR-24高表達組顯著升高，特別是小管形成數(shù)量、及管腔長度與空白質(zhì)粒對照組相近。

結(jié)論： miR-24顯著抑制HUVECs的增殖、遷移和管腔形成的能力，并且與miR-24對eNOS的表達調(diào)控有關(guān)；miR-24明顯抑制eNOS表達，Sp1的參與可能是這一調(diào)節(jié)過程的重要分子機制之一。

核糖核酸；管腔；一氧化氮合酶，內(nèi)皮型

Abstract

Objective: To investigate the effects of miR-24 on endothelial nitric oxide synthase （eNOS） gene expression with regulation and endothelial cell proliferation，migration，tube formation in human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）.

Methods:Constructed high expression plasmid of miR-24 and miR-24 antisense sequence were introduced into HUVECs and the cells included in 3 groups: Control group，miR-24 group and miR-24 inhibitor group. HUVEC proliferation was detected by MTT test，migration was measured by Scratching and Transwell methods，tube formation was examined by Matrigel assay； mRNA and protein expressions of eNOS and Sp1were determined by RT-PCR and Western blot analysis respectively.

Results:①Compared with Control group，miR-24 group had decreased cell proliferation by 45.45% as （0.36 ± 0.04） vs （0.66 ± 0.08），P＜0.05； miR-24 group had lower speed of cell migration，decreased number of cell migration by 74.75% as （30.25±3.78） vs （119.80±10.94），P＜0.01 and there was no obvious tube formation.②Compared with Control group，miR-24 group showed reduced eNOS mRNA expression by 46.2% as （0.49±0.02） vs （0.91±0.01），P＜0.05，reduced protein expression by 49.07% as （0.55±0.05） vs （1.08±0.05），P＜0.05； meanwhile，decreased Sp1 mRNA expression by44.9% as （0.49±0. 01） vs （0. 89±0.02） P＜0.05，decreased protein expression by 54.90% as （0.46±0.02） vs （1.02±0.04），P＜0.05. In miR-24 inhibitor group，the above indexes were lower than Control group but higher than miR-24 group，the amount of tube formation and the length of tubes were similar between Control group and miR-24 inhibitor group.

Conclusion:MiR-24 may inhibit HUVECs proliferation，migration，tube formation and suppress eNOS expression； Sp1 might be one of the important regulators.

（Chinese Circulation Journal，2016，31:797.）

近年來研究顯示，一些微小核糖核酸（MicroRNA）可通過調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和形態(tài)變化進而調(diào)控血管生成。然而，這些miRNAs的表達異常參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展［1，2］。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是內(nèi)皮組織特異型基因，介導(dǎo)大部分的血管內(nèi)源性一氧化氮（NO）合成，后者不僅是調(diào)節(jié)血管緊張度的舒張因子，而且在內(nèi)皮細胞生長、遷移、血管重構(gòu)和血管生成等方面起著至關(guān)重要的作用［3］。Sp1是鋅指蛋白家族中最具代表性的一員，通過三個保守的鋅指結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，在許多基因的表達過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。令人感興趣的是，eNOS核心啟動子區(qū)域的GC盒含有Sp1的高親和位點，且Sp1是eNOS的必需轉(zhuǎn)錄因子。我們前期研究提示microRNA-24 （miR-24）對內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)控與其抑制eNOS和Sp1的表達有關(guān)［4］。然而，miR-24抑制eNOS的表達是否參與血管生成的調(diào)控，目前尚不清楚。

為進一步探討miR-24對eNOS和Sp1表達調(diào)節(jié)的分子機制，以及該過程對內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成能力的影響，本實驗選取人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）為實驗?zāi)Ｐ?，?gòu)建的miRNA-24及其反義序列的高表達質(zhì)粒，然后分別轉(zhuǎn)染HUVECs，觀測HUVECs的增殖、遷移和血管形成情況，并檢測 eNOS和核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達變化情況。

1　材料與方法

試驗材料：HUVECs（Procell，中國武漢）；1640細胞培養(yǎng)基（Gibco，上海立菲生物技術(shù)有限公司）；胎牛血清（Gibco，澳洲）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（索萊寶科技有限公司，中國北京）；人工基底膜（Matrigel）（Corning，美國）；載體 miRNA SelectTMpEGP-miR（Cell Biolabs，美國）；質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國北京）；X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（Roche，德國）；總RNA提取試劑盒（TRIzol法）（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，中國北京）；RT試劑盒（MBI公司，美國）；PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，中國北京）；eNOS、Sp1兔源多克隆抗體（Abcam，英國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（Santa Cruz，美國）。

miR-24高表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：miRNA-24序列（來 自 http://www.miRbase.org）為 5`UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3`；anti-miRNA-24用于下調(diào) miR-24并干擾其作用，序列與miR-24互補，5`-ACCGAGUCAAGUCGUCCUUGUC-3`。對照組為隨機序列，5`-GUCAUCAGUCGAGCUAGACGAG-3`。使用脫氧核糖核酸（DNA）合成技術(shù)得到第一鏈DNA，通過DNA連接反應(yīng)合成相應(yīng)的雙鏈DNA，隨后經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增并進行體外重組，最終插入pEGP-miR載體，載體分別命名為pEGP-miRNA-24、pEGP-anti-miRNA-24和 pEGP-control。分別將載體轉(zhuǎn)化入 E.coliDH5α感受態(tài)宿主菌并于氨芐抗性的平板上培養(yǎng)，挑取經(jīng)酶切初步證實插入正確的單克隆菌落，搖菌后提取質(zhì)粒DNA并寄上海生工進行DNA序列測定。

HUVECs的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HUVECs用含有1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中。提取的質(zhì)粒分別使用NANO核酸測定儀測定濃度，重復(fù)3次，取平均值。然后使用無血清1640培養(yǎng)液將質(zhì)粒稀釋至濃度為0.01 μg/ μl，并將X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒按3 μl：1 μg比例混合，取生長正常的HUVECs孵育，24 h后更換含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h觀察免疫熒光。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒將實驗細胞分為：miR-24高表達組、miR-24 干擾組和空白質(zhì)粒對照組。

MTT檢測HUVECs的增殖能力：按文獻［5］的方法通過MTT檢測HUVECs的增殖能力。各組細胞分別以每孔5×103個接種到96孔板，待細胞達到50%融合時更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h實現(xiàn)細胞同步生長。接種后24、48和72 h，每孔加10μl MTT繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl二甲基亞砜，震蕩15 s，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm的波長下測定吸光度（OD值），實驗重復(fù)3次。

劃痕和Transwell檢測HUVECs的遷移能力：按文獻［6］的方法通過劃痕檢測HUVECs的遷移能力。各組細胞分別以4×105個接種到6孔板，待細胞融合后用，用移液槍槍頭垂直培養(yǎng)板底部劃“一”字痕。接著，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（磷酸根濃度=0.01 mol/L，pH=7.4）沖洗3遍，將懸浮細胞洗脫，加入無血清1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于0 h和24 h觀察細胞遷移情況并測量劃痕寬度，遷移比例=（劃痕0 h后劃痕寬度-劃痕24 h后劃痕寬度）/劃痕0 h后劃痕寬度，實驗重復(fù)3次。

按文獻［3］的方法通過transwell檢測HUVECs的遷移能力。各組細胞預(yù)先用無血清1640培養(yǎng)基饑餓12 h，各組細胞消化后用無血清1640重懸并以1×104個接種到Transwell上層小室，下層小室均加入500 μl的含血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。12 h后取出上層小室，用棉簽小心拭去小室內(nèi)的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，取出上層小室用PBS沖洗3次，結(jié)晶紫室溫染色1 h，自來水洗去多余結(jié)晶紫，倒置顯微鏡下觀察Transwell小室膜下的細胞（每組隨機取5個視野進行細胞計數(shù)，取平均值表示），實驗重復(fù)3次。

Matrigel檢測HUVECs的成管能力：按文獻［3］的方法通過人工基底膜（Matrigel）檢測HUVECs的成管能力。預(yù)先將Matrigel放置于4℃冰箱過夜解凍，以每孔20 μl鋪于96孔板中，冰上操作。然后將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置1 h。各組細胞消化后用無血清培養(yǎng)基重懸并以1×104個分別種于鋪好的Matrigel上，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后鏡下觀察并分析小管數(shù)量（隨機取5個視野）。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染前后eNOS和Sp1 mRNA的表達：按照TRIzol試劑盒說明書提取各組的細胞總RNA。利用Primer 5.0軟件設(shè)計合成人種屬eNOS、Sp1以及β-actin的引物（序列見表1）。分別取細胞總RNA 1μg，加入1.0 μl（0.5 g/L）Oligo（dT）18引物，70 ℃變性 5 min，迅速置于冰上冷卻。加入4μl 5×reaction buffer，1 μl RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor（20 U/μl），2 μl 10 mmol/L dNTP Mix，37℃溫育5 min，加入1 μl逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃1 h，之后 70℃10 min終止反應(yīng)，合成cDNA第1條鏈。PCR擴增反應(yīng)：94 ℃ 預(yù)變性5 min后，開始30個循環(huán)： 94℃ 30 s、56℃ 1 min、72℃ 1 min；最后72℃ 5 min，終止反應(yīng)。取5μl PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1　引物序列

免疫蛋白印跡法檢測 eNOS 和 Sp1 蛋白的表達：分別將各組細胞裂解，以8000 g離心力、4℃離心15 min，取上清。各組分別取蛋白30μg進行SDS-PAGE（8%）分離并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。經(jīng)脫脂奶粉封閉1 h后加入eNOS和Sp1Ⅰ抗?jié)窈羞^夜（4℃）。TBST（0.14 mol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，24.8 mmol/L Trise base，1%吐溫，pH=7.4）沖洗3次（每次10 min），加入Ⅱ抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）孵育，1 h后重復(fù)用TBST沖洗（方法同上）。利用LI-COR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析。

統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，采用LSD-t和SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-24對HUVECs增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示miR-24高表達組細胞增殖明顯受到抑制。培養(yǎng)72 h后，與空白質(zhì)粒對照組相比，miR-24高表達組OD值降低45.45%（0.36±0.04 vs 0.66±0.08，P＜0.05）；miR-24干 擾 組OD值降低18.18%（0.54±0.05 vs 0.66±0.08，P＜0.05）。與miR-24高表達組相比，miR-24干擾組OD值則增加50.00%（0.54±0.05 vs 0.36±0.04，P＜0.05）。可見miR-24對HUVECs的增殖具有一定的抑制作用。

2.2miR-24對HUVECs遷移的影響

細胞劃痕實驗顯示（圖1），與空白質(zhì)粒對照組相比，劃痕24 h后miR-24高表達組HUVECs的遷移比例降低42.68%（0.47± 0.02 vs 0.82±0.01，P＜0.05）；miR-24干擾組HUVECs的遷移比例降低18.29%（0.67± 0.01 vs 0.82±0.01，P＜0.05）。與miR-24高表達組相比，miR-24干擾組HUVECs的遷移比例則增加42.55%（0.67± 0.01 vs 0.47± 0.02，P＜0.05）。

為了闡明miR-24對HUVECs遷移能力的影響，本實驗選擇Transwell試驗進行再一次驗證。Transwell結(jié)果以鏡下被染色的細胞判定（見圖2），并計數(shù)對比各組差異。與空白質(zhì)粒對照組比較，miR-24高表達組細胞遷移數(shù)目明顯降低74.75% （30.25±3.78 vs 119.80±10.94，P＜0.01），miR-24干擾組細胞遷移數(shù)降低34.89%（78.00±4.30 vs 119.80±10.94，P＜0.01）； 而與 miR-24高表達組比較，miR-24干擾組細胞遷移數(shù)則增加157.85%（78.00±4.30 vs 30.25±3.78，P＜0.01）?？梢妋iR-24對HUVECs的遷移能力具有一定的抑制作用。

圖1　微小核糖核酸-24對人臍靜脈內(nèi)皮細胞運動性的影響 （×100，n=3）

圖2　微小核糖核酸-24對人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移的影響 （×100，n=3）

2.3miR-24對HUVECs管腔形成的影響（圖3）

HUVECs的增殖和遷移能力與管腔形成密切相關(guān)，為了明確miR-24對HUVECs管腔形成的影響，本實驗選擇Matrigel試驗進行驗證。結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對照組相比，miR-24干擾組HUVECs所形成的管腔數(shù)目、長度及寬度均較小，而miR-24高表達組HUVECs有聚集傾向，但未能形成管腔樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。綜上，miR-24對HUVECs的管腔形成具有一定的抑制作用。

圖3　微小核糖核酸-24對人臍靜脈內(nèi)皮細胞管腔形成的影響（×100，n=3）

2.4miR-24對HUVECs eNOS 和Sp1 mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對照組相比，miR-24高表達組的eNOS mRNA表達量降低46.2% （0.49±0.02 vs 0.91±0.01，P＜0.05），miR-24干擾組的eNOS mRNA表達量降低 17.6% （0.75±0.03 vs 0.91±0.01，P＜0.05）。 而 與miR-24高 表 達 組相比，miR-24干擾組增加了53.06%（0.75±0.03 vs 0.49±0.02，P＜0.05）。 可 見miR-24明 顯 降 低HUVECs的eNOS mRNA水平。

與空白質(zhì)粒對照組相比，miR-24高表達組的Sp1 mRNA表達量降 低44.9%（0.49±0.01 vs 0.89±0.02，P＜0.05），miR-24干擾組的Sp1 mRNA 表 達 量 降 低 18.0%（0.73±0.02 vs 0.89±0.02，P＜0.05）。而與miR-24高表達組相比，miR-24干擾 組 增 加 了 48.98%（0.73±0.02 vs 0.49±0.01，P＜0.05）?？梢妋iR-24明顯降低HUVECs的Sp1 mRNA水平。

2.5miR-24對HUVECs eNOS和Sp1蛋白表達的影響

Western blotting的檢測結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒對照組相比，miR-24高表達組的eNOS蛋白表 達 量 下 降 49.07%（0.55±0.05 vs 1.08±0.05，P＜0.05），miR-24干擾組下降20.37% （0.86±0.07 vs 1.08±0.05，P＜0.05）；而與miR-24高表達組比較，miR-24 干擾組增加了56.36%（0.86±0.07 vs 0.55±0.05，P＜0.05）。結(jié)果顯示，miR-24明顯降低HUVECs 的eNOS蛋白水平。

通過Western blotting對Sp1蛋白表達量進行分析，miR-24高表達組轉(zhuǎn)錄因子Sp1 的表達量比對照組下調(diào)54.90%（0.46±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）；miR-24干擾組轉(zhuǎn)錄因子Sp1的表達量比對照組下調(diào)27.45%（0.74±0.02 vs 1.02±0.04，P＜0.05）。與miR-24高表達組比較，miR-24 干擾組蛋白表達量增加了60.87%（0.74±0.02 vs 0.46±0.02，P＜0.05）。結(jié)果顯示，miR-24明顯降低HUVECs轉(zhuǎn)錄因子Sp1蛋白水平。

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-24對HUVECs的eNOS和轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達具有明顯的抑制作用，而且Sp1可能作為重要的調(diào)節(jié)分子與miR-24共同參與對eNOS的表達調(diào)控。進一步發(fā)現(xiàn)，該調(diào)控機制可能與miR-24抑制HUVECs的管腔形成有關(guān)。另外，我們再一次驗證了miR-24對HUVECs增殖的抑制作用，因此推測miR-24可能通過調(diào)控內(nèi)皮細胞的增殖和管腔形成能力進而調(diào)控血管生成。

血管生成是從原有的血管上形成新血管的過程，不僅貫穿整個生命過程，而且在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。近年來，研究表明，血管生成與某些miRNA的調(diào)控密切相關(guān)。例如干擾內(nèi)皮型miRNA的成熟將影響內(nèi)皮細胞功能以及內(nèi)皮細胞的血管形成能力；大鼠妊娠期敲除Dicer基因使血管發(fā)生異常，甚至導(dǎo)致胚胎死亡。miR-24屬于miR-23～27～24家族，在心臟特別是血管組織表達最高［7］。值得注意的是，在高血壓患者血漿中有16個miRNA明顯下調(diào)，而miR-24等14個miRNA則明顯上調(diào)，而且miR-24與高血壓的嚴(yán)重程度和并發(fā)癥呈現(xiàn)正相關(guān)。然而，雖然近年來有關(guān)miR-24在心肌梗死過程中調(diào)控心肌細胞凋亡的研究已取得重大進展，其相應(yīng)的信號通路以及發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也逐步被闡明，但miR-24通過調(diào)控內(nèi)皮細胞功能促進血管生成的研究仍處于起步狀態(tài)。

eNOS是組織特異性基因，其產(chǎn)物NO不僅是調(diào)節(jié)血管緊張度的舒張因子，而且在內(nèi)皮細胞生長、遷移、血管重構(gòu)和血管生成等方面起著至關(guān)重要的作用［3］。然而，隨著年齡的增長或病理過程的發(fā)展，內(nèi)皮細胞功能障礙引起的NO生成減少，將導(dǎo)致血管新生功能減弱，以及血管內(nèi)皮受損區(qū)域的修復(fù)能力顯著降低［8］。例如，心血管疾病患者體內(nèi)NO產(chǎn)量減少，且循環(huán)內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和血管內(nèi)皮修復(fù)功能降低［9］。通過刺激內(nèi)皮細胞遷移促進血管內(nèi)皮修復(fù)及毛細血管的形成治療心血管疾病，得到了普遍認(rèn)可。目前，在缺血性心臟病的治療中，干細胞移植療法是一個新穎而頗具前景的選擇［10，11］。近期體外試驗證實，eNOS的表達與間充質(zhì)干細胞的遷移能力密切相關(guān)［12］，有進一步研究提示，鋅指蛋白可通過促進內(nèi)皮祖細胞的eNOS表達促進其定向內(nèi)皮細胞分化。而Sp1是鋅指蛋白家族中最具代表性的一員，eNOS核心啟動子區(qū)域的GC盒含有Sp1的高親和位點，且Sp1是eNOS的必需轉(zhuǎn)錄因子。引人注目的是，miR-24可促進干細胞定向分化及表達心血管祖細胞（cardiovascular progenitor cells，CPC）功能，并提高CPC移植到心臟MI區(qū)域后的存活率［13］，促進血漿中干細胞通過趨化作用富集并進入血管壁，使血管穩(wěn)定成熟，但其調(diào)控機制尚不明晰。

綜上所述，本研究已證明miR-24可能通過調(diào)節(jié)eNOS和Sp1對HUVECs的增殖和管腔形成具有一定的抑制作用。然而該調(diào)控機制是否對血管生成具有調(diào)控作用，以及是否參與干細胞定向內(nèi)皮細胞分化，仍需進一步探討。

［1］Zhou Q，Anderson C，Zhang H，et al. Repression of choroidal neovascularization through actin cytoskeleton pathways by microRNA-24. Mol Ther，2014，22： 378-389.

［2］Lorenzen JM，Kaucsar T，Schauerte C，et al. MicroRNA-24 Antagonism Prevents Renal Ischemia Reperfusion Injury. J Am Soc Nephrol，2014，25： 2717-2729.

［3］Huang JJ，Shi YQ，Li RL，et al. Angiogenesis effect of therapeutic ultrasound on HUVECs through activation of the PI3K-Akt-eNOS signal pathway. Am J Transl Res，2015，7： 1106-1115.

［4］Zhang W，Yan L，Li Y，et al. Roles of miRNA-24 in regulating endothelial nitric oxide synthase expression and vascular endothelial cell proliferation. Mol Cell Biochem，2015，405： 281-289.

［5］Hung HS，Chang CH，Chang CJ，et al. In Vitro Study of a Novel Nanogold-Collagen Composite to Enhance the Mesenchymal Stem Cell Behavior for Vascular Regeneration. PLoS One，2014，9： e104019.

［6］Pafumi I，F(xiàn)avia A，Gambara G，et al. Regulation of Angiogenic Functions by Angiopoietins through Calcium-Dependent Signaling Pathways. Biomed Res Int，2015，2015： 965271.

［7］Zhou Q，Gallagher R，Ufret-Vincenty R，et al. Regulation of angiogenesis and choroidal neovascularization by members of microRNA-23～27～24 clusters. Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108：8287-8292.

［8］趙艷霞，格日力. 內(nèi)皮型一氧化氮合酶脫偶聯(lián)在心血管疾病中的致病作用. 中國循環(huán)雜志，2014，4： 315-318.

［9］Schmidt-Lucke C，R?ssig L，F(xiàn)ichtlscherer S，et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events： proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation，2005，111： 2981-2987.

［10］Premer C，Blum A，Bellio MA，et al. Allogeneic Mesenchymal Stem Cells Restore Endothelial Function in Heart Failure by Stimulating Endothelial Progenitor Cells. E Bio Medicine，2015，2： 467-475.

［11］李玲，石蓓. 心臟干細胞移植治療缺血性心臟病的研究進展. 中國循環(huán)雜志，2015，3： 290-292.

［12］Lin YL，Yet SF，Hsu YT，et al. Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Atherosclerotic Lesions via Restoring Endothelial Function. Stem Cells Transl Med，2015，4： 44-55.

［13］Hu S，Huang M，Nguyen PK，et al. Novel microRNA prosurvival cocktail for improving engraftment and function of cardiac progenitor cell transplantation. Circulation，2011，124（11 Suppl）： S27-34.

Effects of miR-24 on Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Expression and Tube Formation in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

CHEN Wei，MO Guo-jun，LUO Xue-lan，WANG Hui，YANG Peng，OU He-sheng.
College of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning （530021），Guangxi，China
Corresponding Author: OU He-sheng，hsou01@yahoo.com

RNA； Tube formation； Endothelial nitric oxide synthase； Sp1

2015-11-22）

（編輯：許菁）

國家自然科學(xué)基金項目（81373403）；廣西研究生科研創(chuàng)新項目（YCSZ2015119）

530021廣西壯族自治區(qū)南寧市，廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

陳偉碩士研究生主要研究方向：心血管分子藥理學(xué)Email：chenwei_mir2013@163.com通訊作者：歐和生Email：hsou01@yahoo.com

R54

A

1000-3614（2016）08-0797-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.08.017