單次大劑量阿托伐他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及Rho激酶活性的影響

謝蓮娜，王麗君，王凱君，魏顯敬，解澤宙

單次大劑量阿托伐他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及Rho激酶活性的影響

謝蓮娜，王麗君，王凱君，魏顯敬，解澤宙

目的：通過觀察單次大劑量阿托伐他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及外周血白細(xì)胞Rho激酶活性的影響，探討他汀改善不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的可能機制。

方法：入選2012-08至2014-02入住我院的不穩(wěn)定性心絞痛患者78例，入院當(dāng)日給予阿托伐他汀80 mg一次頓服。分別于服藥前及服藥后12 h以超聲測反應(yīng)性充血前后肱動脈內(nèi)徑（FMD）的變化，以免疫印跡法（Western Blot）測外周血白細(xì)胞肌球蛋白輕鏈磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞單位（MYPT1）及在Thr853位上磷酸化的MYPT1（p-MYPT1Thr853）蛋白表達，以p-MYPT1Thr853占總MYPT1的百分比表示Rho激酶的活性。

結(jié)果：患者服用阿托伐他汀80 mg 12 h后，F(xiàn)MD較治療前增加28.15% ［（6.50±1.68）% vs （8.33±1.93）%，P＜0.001］，外周血白細(xì)胞Rho激酶活性較治療前降低32.78% ［（58.91±5.22）%vs （39.6±3.85）%，P=0.002］。

結(jié)論：大劑量阿托伐他汀能快速改善不穩(wěn)定性心絞痛患者的血管內(nèi)皮功能，RhoA/Rho激酶通路抑制參與他汀類藥物快速改善血管內(nèi)皮功能的作用。

阿托伐他汀；內(nèi)皮，血管；Rho激酶；心絞痛，不穩(wěn)定型

Abstract

Objective:To explore the possible mechanism of statins improving endothelial function via observing the effect of a high single dose atorvastatin on endothelial dysfunction and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity in patients with unstable angina （UA）.

Methods:A total of 78 consecutive UA patients admitted in our hospital from 2012-08 to 2014-02 were enrolled. The patients received a single dose of atorvastatin 80 mg on the day of admission. Flow-mediated vasodilation （FMD） of brachial artery was examined by high-resolution ultrasound at before and 12 hours after medication. Protein expression of phospho-specific Thr853-MYPT1 （p-MYPT1Thr853） and MYPT1 was measured by Western blot analysis； peripheral blood leukocyte Rho kinase activity was assayed by the proportion of phospho-Thr853 in myosin binding subunit of light chain phosphatase （MYPT1）.

Results:Compared to prior medication，with atorvastatin 80 mg for 12 hours，F(xiàn)MD was increased 28.15% as （6.50 ±1.68） % vs （8.33 ± 1.93） %，P＜0.001 and peripheral blood leucocyte Rho kinase activity was decreased 32.78% as （58.91 ± 5.22） % vs （39.6 ± 3.85 ） %，P=0.002.

Conclusion:High dose atorvastatin could rapidly improve vascular endothelial dysfunction in UA patients. inhibiting of RhoA/Rho kinase pathway may involve in the effect of statins improving endothelial function.

（Chinese Circulation Journal，2016，31:746.）

他汀類藥物是臨床中廣泛使用的抗動脈粥樣硬化基礎(chǔ)用藥。強效降低低密度脂蛋白膽固醇是他汀類藥物臨床獲益的基礎(chǔ)。他汀類藥物通過抑制3-羥3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶的活性，在抑制膽固醇合成的同時減少類異戊二烯介質(zhì)的生成、抑制細(xì)胞內(nèi)RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性［1］。RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活所致的血管內(nèi)皮功能障礙在不穩(wěn)定性心絞痛發(fā)病中具有重要的作用。本研究通過觀察單次大劑量阿托伐他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能及外周血白細(xì)胞Rho激酶活性的影響，探討他汀改善不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的可能機制。

1　資料與方法

研究對象：入選2012-08至2014-02入住我院的不穩(wěn)定性心絞痛患者78例。不穩(wěn)定性心絞痛包括：初發(fā)勞累心絞痛、惡化勞累心絞痛、靜息心絞痛。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往對他汀類藥物不耐受、有肝臟疾病史、有肌肉疾病史、腎功能不全、2周內(nèi)使用他汀類藥物。

試驗步驟：符合入選條件的患者入院當(dāng)日在填寫知情同意書后，一次性服阿托伐他汀80 mg。在服藥前及服藥12 h后分別取靜脈血20 ml，進行白細(xì)胞分離，用于測定Rho激酶活性；同時于服藥前及服藥12 h后進行非創(chuàng)傷性血管內(nèi)皮功能檢查。入院次日空腹取靜脈血進行常規(guī)生化檢測包括：肝功能、腎功能、血糖、血脂等。

非創(chuàng)傷性血管內(nèi)皮功能檢查：以反應(yīng)性充血前后肱動脈內(nèi)徑（FMD）的變化反映內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。應(yīng)用飛利浦 SONOS 5500彩色超聲顯像儀（Agilent 科技公司，美國），分別測量患者休息時、反應(yīng)性充血后肱動脈內(nèi)徑。受試者測試前休息10 min，在測定肱動脈內(nèi)徑基礎(chǔ)值（D0）后進行反應(yīng)性充血試驗：將血壓計袖帶置于肘上，沖氣加壓至250 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），4min后迅速將袖帶放氣減壓，放氣后60～90 s內(nèi)在同一部位測肱動脈的內(nèi)徑（D1）。FMD=（D1-D0）/D0×100%。

白細(xì)胞分離：靜脈血20 ml加入EDTA-K+抗凝管，水平式離心機200 g離心20 min，用微量移液器吸取血漿，加入紅細(xì)胞裂解液，用水平式離心機800～1200 g離心30 min，棄上清，沉淀即為白細(xì)胞，-80℃保存，批量檢測Rho激酶活性。

Rho激酶活性測定：Rho激酶激活后在Thr853位上磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶的肌球蛋白結(jié)合亞單位（MYPT1）使肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活。應(yīng)用免疫印跡法（Western Blot）測定不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血白細(xì)胞MYPT1蛋白及在Thr853位上磷酸化的MYPT-1（p-MYPT1Thr853）蛋白表達，以MYPT1磷酸化程度（p-MYPT1Thr853占總MYPT1的百分比）表示Rho激酶的活性。白細(xì)胞裂解后，高速離心，上清蛋白定量。取20 μg蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，用水浴式電轉(zhuǎn)移裝置將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore，美國），進行免疫印跡反應(yīng)。一抗：兔抗人多克隆MYPT1抗體（1：500，Santa Cruz，美國），兔抗人多克隆p-MYPT1Thr853抗體 （1：500，Santa Cruz，美國）。二抗：山羊抗兔 IgG （1：4000，福州邁新）。增強化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色、顯影、定影。將顯色條帶膠片掃描至計算機中，應(yīng)用Quantity One凝膠定量軟件（Bio-Rad，美國）對目的電泳條帶進行分析，測目的條帶的積分光密度值，記錄結(jié)果。計算MYPT1磷酸化程度：p-MYPT1Thr853積分光密度/總MYPT1積分光密度×100%（p-MYPT1Thr853/ MYPT1×100%）。

統(tǒng)計學(xué)處理：用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。治療前后各參數(shù)比較用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

患者一般臨床資料：78例患者平均年齡（64.97±10.67）歲，男53例，女25例，陳舊性心肌梗死5例，既往冠狀動脈介入治療7例。患者的血漿平均甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平依次為（1.86±1.09）mmol/L、 （4.93±1.17）mmol/L、（3.08±1.15）mmol/L和（1.12±0.26）mmol/L。其他冠心病相關(guān)危險因素分布情況及心血管藥物使用情況見表1。

表1　78例患者冠心病相關(guān)危險因素及臨床用藥情況

單次大劑量他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的影響：應(yīng)用超聲檢測比較患者入院時及服用80 mg 阿托伐他汀12 h后FMD。該組不穩(wěn)定性心絞痛患者入院時FMD為（6.50±1.68） %，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后FMD為（8.33 ±1.93）%，較入院時增加28.15%（P＜0.001）。

單次大劑量他汀對不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血白細(xì)胞Rho激酶活性的影響（圖1）：應(yīng)用免疫印跡法測定患者入院時及服用80 mg阿托伐他汀 12 h后外周血白細(xì)胞MYPT1及p-MYPT1Thr853蛋白表達，計算并比較Rho激酶活性。入院時患者外周血白細(xì)胞Rho激酶活性為（58.91±5.22）%，服用阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白細(xì)胞Rho激酶活性為（39.6±3.85）%，較入院時降低32.78%（P=0.002）。

圖1　免疫印跡法分析不穩(wěn)定性心絞痛患者服用阿托伐他汀前后外周血白細(xì)胞中p-MYPT1Thr853和MYPT1蛋白水平（Rho激酶活性）

3　討論

血管內(nèi)皮功能障礙是急性冠狀動脈綜合征包括不穩(wěn)定性心絞痛的重要發(fā)病機制之一?；A(chǔ)及臨床研究充分證實，他汀類藥物具有改善血管內(nèi)皮功能的作用。早期臨床研究證實，單劑量他汀能快速改善健康受試者及穩(wěn)定性冠心病患者血管內(nèi)皮功能。Omori等［2］給予膽固醇水平正常的健康受試者口服單劑量西立伐他汀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用西立伐他汀3 h 后FMD明顯增加。Wassmann等［3］給予穩(wěn)定性心絞痛患者普伐他汀40 mg一次口服，于用藥前及用藥24 h后觀察乙酰膽堿誘發(fā)的冠狀動脈痙攣，結(jié)果顯示，應(yīng)用40 mg普伐他汀24 h后乙酰膽堿誘發(fā)的冠狀動脈痙攣明顯改善。近期Kono等［4］的研究顯示，單劑量匹伐他汀能在2 h內(nèi)改善冠狀動脈疾病患者的外周微血管功能。

基于以上研究，本研究觀察一次口服阿托伐他汀80 mg對不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的影響，結(jié)果顯示，不穩(wěn)定性心絞痛患者一次口服80 mg阿托伐他汀12 h后FMD增加28.15%，提示單次大劑量阿托伐他汀具有快速改善不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的作用。血管內(nèi)皮功能障礙是急性冠狀動脈綜合征包括不穩(wěn)定性心絞痛發(fā)生心血管事件及心血管死亡的重要機制，入院后即刻給予大劑量阿托伐他汀能快速改善血管內(nèi)皮功能，有助于改善不穩(wěn)定性心絞痛患者的臨床預(yù)后。

近年來，國內(nèi)外研究者對他汀降脂以外的作用機制進行了深入的探討，證實RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛參與了他汀類藥物的降脂外作用［5］。RhoA是小G蛋白超家族中的一個亞族，廣泛分布于哺乳動物的組織細(xì)胞中。膽固醇合成中的中間產(chǎn)物類異戊二烯介質(zhì)是RhoA激活的必要物質(zhì)基礎(chǔ)。這些類異戊二烯介質(zhì)與RhoA的C末端相連，增加RhoA的親脂性 （異戊烯化），促使其定位在細(xì)胞膜上而激活。Rho激酶是160 kDa的蛋白絲氨酸/酪氨酸激酶，是RhoA的主要效應(yīng)蛋白。RhoA激活后通過激活Rho激酶發(fā)揮其重要生理功能。他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶，在抑制膽固醇合成的同時，減少類異戊二烯介質(zhì)的生成，抑制RhoA的異戊烯化，進而抑制Rho激酶的活性［1］。有關(guān)他汀類藥物抑制Rho激酶活性的作用已在基礎(chǔ)研究方面獲得充分的驗證。RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一氧化氮合酶（eNOS）表達及激活的重要調(diào)節(jié)機制。體外研究證實［6］，他汀通過抑制RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性上調(diào)eNOS表達，增強eNOS活性。既往臨床研究證實，應(yīng)用他汀4周能使動脈粥樣硬化患者外周血白細(xì)胞Rho激酶的活性降低40%～53%，同時明顯改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能［7，8］。但應(yīng)用他汀4周的結(jié)論并不能用于解釋短期負(fù)荷他汀所帶來的臨床獲益［9］。ARMYDA-RECAPTURE研究證實，在冠狀動脈介入術(shù)前12 h負(fù)荷80 mg阿托伐他汀能明顯減少冠狀動脈介入術(shù)后30 d主要心血管事件［10］。基于此，本研究觀察阿托伐他汀80 mg 一次口服對不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血白細(xì)胞Rho激酶活性的影響，結(jié)果顯示，不穩(wěn)定性心絞痛患者一次口服阿托伐他汀80 mg 12 h后外周血白細(xì)胞Rho激酶活性較治療前降低32.78%，提示大劑量他汀能快速抑制不穩(wěn)定性心絞痛患者Rho激酶的活性。Wolfrum等［11］通過人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Rho激酶抑制劑鹽酸法舒地爾能在15 min內(nèi)激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶（PI3K/ Akt）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使一氧化氮（NO） 釋放增加4倍。綜合上述研究結(jié)果，推測抑制RhoA/Rho激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性是單次大劑量阿托伐他汀快速改善不穩(wěn)定性心絞痛患者血管內(nèi)皮功能的重要機制。

此外，阿托伐他汀能快速改善血管內(nèi)皮功能可能部分是源于其脂溶性特征。由于細(xì)胞膜由雙層脂質(zhì)組成，他汀的細(xì)胞內(nèi)作用效果在脂溶性他汀和水溶性他汀之間是不同的。Jantzen等［12］研究顯示，糖尿病患者脂溶性他汀西立伐他汀在12 h內(nèi)增加eNOS表達的作用強于水溶性他汀瑞舒伐他汀。因此阿托伐他汀能快速進入血管壁、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞Rho激酶活性、增加NO的生物利用度是其快速改善血管內(nèi)皮功能的機制之一。

本文局限性：外周血白細(xì)胞Rho激酶活性只是間接反映血管組織Rho激酶活性。

綜上所述，我們認(rèn)為，大劑量阿托伐他汀能快速改善不穩(wěn)定性心絞痛患者的血管內(nèi)皮功能，RhoA/ Rho激酶通路抑制參與他汀類藥物快速改善血管內(nèi)皮功能的作用。

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Effect of a High Single Dose Atorvastatin on Endothelial Function and Rho Kinase Activity in Patients With Unstable Angina

XIE Lian-na，WANG Li-jun，WANG Kai-jun，WEI Xian-jing，XIE Ze-zhou.
Department of Cardiology，Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian （116001），Liaoning，China
Corresponding Author: XIE Lian-na，Email: xieln1963@163.com

Atorvastatin； Endothelial function； Rho kinase； Unstable angina

2015-11-21）

（編輯：朱柳媛）

2011年大連市醫(yī)學(xué)衛(wèi)生科學(xué)技術(shù)研究項目

116001遼寧省大連市，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院循環(huán)科

謝蓮娜主任醫(yī)師博士主要專業(yè)方向：心血管疾病臨床診治、冠心病介入治療、冠脈痙攣機制探討Email： xieln1963@163.com通訊作者：謝蓮娜

R541.4

A

1000-3614（2016）08-0746-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.08.005