中華蜜蜂觸角特異蛋白AcerASP4結(jié)合特性研究

鄧培淵， 李俊杰， 李玉華， 王林青， 李長看

(1.鄭州師范學(xué)院生物物種資源研究中心，河南 鄭州 450044；2.鄭州市生物物種資源研究重點實驗室，河南 鄭州 450044；3.鄭州市電子信息工程學(xué)校，河南 鄭州 450007)

中華蜜蜂觸角特異蛋白AcerASP4結(jié)合特性研究

鄧培淵1,2， 李俊杰3， 李玉華1， 王林青1， 李長看1

(1.鄭州師范學(xué)院生物物種資源研究中心，河南 鄭州 450044；2.鄭州市生物物種資源研究重點實驗室，河南 鄭州 450044；3.鄭州市電子信息工程學(xué)校，河南 鄭州 450007)

運用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR克隆和正確表達了中華蜜蜂AcerASP4基因，通過熒光競爭結(jié)合實驗測定重組AcerASP4蛋白與29種配基結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)其與辛醛、苯甲醛、順-茉莉酮、吲哚、苯基乙醇和十六酸甲酯結(jié)合，解離常數(shù)分別為7.91、10.49、11.89、13.93、26.10、37.31 μmol·L-1，據(jù)此推測AcerASP4參與了中華蜜蜂對這6種氣味分子識別的生理過程。

中華蜜蜂；氣味結(jié)合蛋白；熒光競爭結(jié)合實驗；解離常數(shù)

中華蜜蜂Apisceranacerana(簡稱中蜂)是生活于中國境內(nèi)東方蜜蜂的地理品種，其嗅覺靈敏并具有強烈的排異性，抗螨能力強，能夠利用零星分散的蜜粉源，是中國重要的飼養(yǎng)蜂種之一。中蜂的優(yōu)良性狀和抗螨能力與敏銳嗅覺系統(tǒng)密不可分[1]，昆蟲嗅覺的敏感性與對其氣味信息物質(zhì)的精確識別及信號傳導(dǎo)相關(guān)[2]，而氣味結(jié)合蛋白(Odorant Binding Proteins，OBPs)和化學(xué)感受蛋白(Chemosensory Proteins，CSPs)直接參與了嗅覺感器與外界氣味分子的化學(xué)反應(yīng)[3]。已有的研究表明，OBPs是一類低相對分子質(zhì)量水溶性酸性蛋白，典型結(jié)構(gòu)具有6個保守的半胱氨酸[4]，OBPs主要存在于昆蟲嗅覺感受器(觸角)胞外的淋巴液中，其作用是結(jié)合并轉(zhuǎn)運脂溶性的氣味分子通過親水性的淋巴液到達嗅覺神經(jīng)樹突末梢[5]，根據(jù)其結(jié)合的配體類型、同源性和感受器上表達類型OBPs進一步分為性信息素結(jié)合蛋白質(zhì)(Pheromone-Binding Protein，PBPs)、普通氣味結(jié)合蛋白質(zhì)(General Odorant-Binding Proteins，GOBPs)和其他類型的觸角氣味結(jié)合蛋白[6]。DANTY等[7]首次發(fā)現(xiàn)了3種觸角特異蛋白ASP(Antenna Special Protein)：ASP1，ASP2和ASP3，后來的研究發(fā)現(xiàn)ASP1為性信息素結(jié)合蛋白PBP[8]，ASP2為普通氣味結(jié)合蛋白GOBP[9]，ASP3為化學(xué)感受蛋白CSP[10]，但未見對中華蜜蜂ASP4的研究報道。為此，本研究運用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR方法克隆中華蜜蜂AcerASP4基因，在細菌中表達后純化，以1-NPN為熒光探針，進行熒光競爭結(jié)合實驗，測定AcerASP4蛋白與主要綠色植物揮發(fā)物和蟲害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物[11]的結(jié)合特性，以期為闡明中華蜜蜂嗅覺發(fā)生的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑、材料和儀器

中華蜜蜂工蜂觸角cDNA為重慶醫(yī)科大學(xué)盧楠博士惠贈；限制性內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶、T4 Ligase連接酶、IPTG和低分子量蛋白標準品購自大連寶生物；熒光探針1-NPN和配基化合物為Sigma公司產(chǎn)品；DE-52柱材料為Whatman產(chǎn)品，AKTA蛋白純化系統(tǒng)和分子篩Superose-12預(yù)裝柱為GE公司產(chǎn)品，熒光光譜儀為Jasco FP-750；pET-30b(+)、DH10B和BL21(DE3)菌株為鄭州市生物物種資源研究重點實驗室保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2AcerASP4基因的克隆、表達和純化

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 從NCBI查取AcerASP4(ID:AY392756.1)的CDS序列，運用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預(yù)測其信號肽序列，依據(jù)成熟編碼區(qū)序列設(shè)計引物如下：AcerASP4-Forward(5’-3’)：ATcatatgCGTCCA

GACGAATCT;AcerASP4-Reverse(5’-3’)：GCgaa

ttcTTAACATTAATGCGC。小寫字母為酶切位點序列，酶切位點之前為保護堿基，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2AcerASP4的克隆、表達和純化AcerASP4擴增體系如下：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP mix 1.6 μL，cDNA 約50 ng，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，72 ℃保溫10 min，ddH2O替代cDNA作空白對照。

擴增產(chǎn)物純化后用Nde I和EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的表達載體pET-30b(+)連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR檢測后得到重組表達載體pET/30b-AcerASP4，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序驗證；正確的pET/30b-AcerASP4轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取單克隆在含10 μg·mL-1，卡納青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，再以1∶100的比例加入新鮮培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)到OD600值為0.7時，加入IPTG(濃度為0.6 mmol·L-1)誘導(dǎo)，3 h后SDS-PAGE檢測。

擴大培養(yǎng)pET/30b-AcerASP4，經(jīng)離心后收集菌體，超聲破碎后檢測重組蛋白的表達形式，若為包涵體用Urea+DTT裂解，用50 mmol·L-1， Tris-HCl (pH 7.4)透析3次復(fù)性。依次經(jīng)陰離子交換樹脂(DE-52柱材料)和分子篩(Superose-12柱材料)進行純化。

1.3熒光競爭結(jié)合試驗

1.3.1 測定AcerASP4蛋白與1-NPN解離常數(shù) 參照LI等[12]和QIAO等[13]的方法，設(shè)置熒光光譜儀337 nm激發(fā)光，掃描300～500 nm范圍的波譜范圍，在5 μmol·L-1AcerASP4蛋白中依次加入1-NPN，終濃度為2～10 μmol·L-1，反應(yīng)3 min，穩(wěn)定后記錄熒光峰值的藍移在5 μmol·L-1AcerASP4蛋白中加為入5 μmol·L-1的1-NPN，放置3 min，加入0～40 μmol·L-1的外源配基(表1)，掃描350～500 nm范圍，熒光強度穩(wěn)定后記錄峰值熒光強度。所得數(shù)據(jù)3次測定的平均值。

1.3.2 測定AcerASP4蛋白與配基的解離常數(shù) 在5 μmol·L-1AcerASP4蛋白中加入10 μmol·L-1的1-NPN,放置2 min,加入0～40 μmol·L-1的外源配基(表1)，掃描350～500 nm范圍，熒光強度穩(wěn)定后記錄強度值。所得數(shù)據(jù)均為3次數(shù)據(jù)的平均值。

1.3.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析 運用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計AcerASP4蛋白與熒光探針1-NPN的解離常數(shù)K[1-NPN]。

運用SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計配基與AcerASP4蛋白結(jié)合的IC50值。

假定AcerASP4蛋白活性為100%，與配基飽和結(jié)合的比例是1∶1，根據(jù)IC50值計算競爭配基的解離常數(shù)。

公式：Ki=IC50/(l+[1-NPN]/K[1-NPN])

其中，[1-NPN]為游離狀態(tài)的1-NPN濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1AcerASP4基因的擴增和表達載體的構(gòu)建

分別以工蜂觸角cDNA和清水為模板擴增AcerASP4基因，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，以cDNA為模板擴增有單一條帶出現(xiàn)，清水則無此條帶，說明AcerASP4基因正確擴增。AcerASP4與pET-30b(+)連接結(jié)果經(jīng)PCR檢測和測序驗證均表明AcerASP4完整且連接成功。

M：Maker DL200；1：AcerASP4基因擴增結(jié)果；2：空白對照。

M：Maker DL200；1：Amplification product ofAcerASP4 gene；2： Blank.

圖1AcerASP4基因擴增結(jié)果
Fig.1AmplificationproductofAcerASP4gene

2.2AcerASP4基因在細菌中的表達和純化

pET/30b-AcerASP4經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在14.3 kD左右有一條特異性條帶出現(xiàn)(圖2泳道2)，而IPTG誘導(dǎo)的空載體pET-30b(+)則無此條帶(圖2泳道1)，表明AcerASP4基因在細菌中正確表達。

重組AcerASP4蛋白經(jīng)檢測大部分以可溶性形式存在于上清液中，經(jīng)離子交換層析和分子篩純化后得到重組蛋白，結(jié)果如圖2泳道3所示：蛋白的

相對分子質(zhì)量大小正確且無明顯的雜帶，說明重組AcerASP4純化質(zhì)量較高，可以用于下一步的熒光競爭結(jié)合試驗。

M：蛋白相對分子質(zhì)量標準；1：誘導(dǎo)的pET-30b (+)；2：誘導(dǎo)的pET/30b-AcerASP4；3：純化后的AcerASP4蛋白。

2.3熒光競爭結(jié)合試驗

在25 ℃恒溫條件下，337 nm的發(fā)射光激發(fā)1-NPN，在475 nm處有小波峰，掃描AcerASP4蛋白無明顯波峰，AcerASP4蛋白與1-NPN混合物，在約400 nm處出現(xiàn)波峰，峰值明顯增強。在5 μmol·L-1，AcerASP4蛋白中加入2～10 μmol·L-11-NPN后400 nm處波峰強度逐漸增加(圖3)，計算得AcerASP4蛋白與1-NPN的解離常數(shù)K[1-NPN]為7.75 μmol·L-1。

圖3 AcerASP4蛋白與1-NPN結(jié)合曲線(A)和Scathard方程(B)Fig.3 Binding curse(A) and Scathard plot of AcerASP4 to 1-NPN

在25 ℃恒溫條件下，測定AcerASP4蛋白與29種配基的結(jié)合能力如圖4和表1所示，6種配基化合物與AcerASP4蛋白結(jié)合，其中辛醛結(jié)合能力最強，解離常數(shù)為7.91 μmol·L-1，苯甲醛、順-茉莉酮和吲哚次之，解離常數(shù)分別為10.49、11.89、13.93 μmol·L-1，苯基乙醇和十六酸甲酯結(jié)合能力較弱，解離常數(shù)分別為26.10、37.31 μmol·L-1，其他配基化合物濃度為40 μmol·L-1時熒光強度無明顯變化，如對甲基苯酚。

3 結(jié)論與討論

昆蟲氣味結(jié)合蛋白能靈敏識別、篩選和轉(zhuǎn)運外界的氣味分子，在昆蟲的寄主定位、尋找配偶等生理活動中起重要作用，其中對氣味分子的選擇性結(jié)合是關(guān)鍵的一步[14]。本研究克隆和表達了中華蜜蜂AcerASP4蛋白，純化的重組蛋白運用熒光競爭結(jié)合實驗分析其結(jié)合特性，由于AcerASP4蛋白中有一色氨酸Try131，在295 nm激發(fā)光作用下在337 nm處有內(nèi)源熒光，表明該殘基處于蛋白質(zhì)結(jié)合腔內(nèi)[15]，加入1-NPN后外源熒光替代內(nèi)源熒光并增強，說明1-NPN結(jié)合于色氨酸附近，位于蛋白質(zhì)的結(jié)合腔內(nèi)[16]；熒光競爭結(jié)合試驗基于配基取代1-NPN與蛋白結(jié)合從而分析蛋白結(jié)合特性。

注：當外源配基濃度達到40 μmol·L-1時熒光強度無明顯變化，則IC50和Ki值標記為空白。

Note：If the flurorescence intensity has no obvious change when external ligand concentrations reached 40 μmol·L-1，theIC50andKiwas recorded as blank.

在熒光競爭結(jié)合試驗中所用的29種氣味分子包括綠葉植物揮發(fā)物、普通氣味分子和蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物3大類，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AcerASP4蛋白結(jié)合的有6種配基，其中辛醛、苯甲醛和十六酸甲酯為普通氣味分子，順-茉莉酮為綠葉植物揮發(fā)物，吲哚為蟲害誘導(dǎo)揮發(fā)物[13]，可見AcerASP4蛋白具有廣譜結(jié)合特性；但醛類物質(zhì)具有較強的結(jié)合能力，可能是醛基工蜂觸角感受器淋巴液中溶解度較高，易于被中蜂識別，但對甲氧基苯甲醛卻不結(jié)合，推測可能是由于苯環(huán)上的甲氧基團的存在改變了淋巴液的pH值和親水性，使配基不能進入蛋白結(jié)合位點附近結(jié)合[17]。

JIANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外源氣味配基結(jié)合能力與碳原子數(shù)相關(guān)，而本研究中發(fā)現(xiàn)配基的結(jié)合能力與碳原子數(shù)不存在正相關(guān)關(guān)系，配基上的基團對結(jié)合能力的影響更大，這可能是由于不同的OBPs類型或者OBPs在不同物種間的作用方式存在差別，也可能是基團的性質(zhì)影響了蛋白疏水性結(jié)合腔的微環(huán)境從而影響了配基的結(jié)合，部分研究也證實也這一點[19]。OBPs不同亞類具有不同的結(jié)合特性，PBPs主要結(jié)合昆蟲性息素，GOBPs主要結(jié)合植物揮發(fā)物[20]，本試驗中3種結(jié)合能力強的配基(解離常數(shù)小于20 μmol·L-1)中辛醛能吸引寄生蘋果蠢蛾Cydiapomouella的蒼白寬口姬小蜂Hyssopuspallidus，其可能是一種昆蟲信息素成份[21]，苯甲醛和順-茉莉酮為果實和綠色植物揮發(fā)物[14]，之前有研究發(fā)現(xiàn)與中蜂AcerASP1為PBPs[8]，AcerASP2為GOBPs[9]，AcerASP3為CSPs[10]?？梢夾cerASP4具有部分PBP和GOBP的結(jié)合特征，推測其可能對AcerASP2和AcerASP2的生理功能起補充作用。

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(責(zé)任編輯：蔣國良)

StudyonbindingspecificityofantennaspecialproteinAcerASP4inChineseHoneybee(Apisceranacerana)

DENG Peiyuan1，2, LI Junjie3, LI Yuhua1, WANG Linqing1, LI Changkan1

(1.Biological Species Resource Research Centre, Zhengzhou Normal University, Zhengzhou 450007, China；2.Zhengzhou Biological Species Resource Research Key Laboratory, Zhengzhou 450044, China；3.Zhengzhou Electronic and Information Engineering School, Zhengzhou 450007, China)

AcerASP4 gene ofApisceranaceranawas cloned using reverse transcription PCR and expressed correctly, and the binding specificity of AcerASP4 to 29 ligands were tested through fluorescence competitive binding assay. The results showed that octanal, benzaldehyde, cis-jasmone, indole, phenethyl alcohol and methyl palmitate could bind to AcerASP4 with the dissociation constants of 7.91, 10.49, 11.89, 13.93, 26.10 and 37.31 μmol·L-1respcetively, with suggests that AcerASP4 may be involved in the physiological process of discriminating those six odor molecules.

Apisceranacerana； odorant binding protein； fluorescence competitive binding assay； dissociation constant

2016-03-29

河南省科技攻關(guān)重點項目(132102110175)

鄧培淵(1981-)，男，河南登封人，講師，博士，從事昆蟲分子生物學(xué)方面的研究。

1000-2340(2016)06-0772-06

Q966

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