丹參藥渣中丹參酮類化學成分的提取富集研究及其利用途徑分析△

戴新新，沈飛，宿樹蘭*，段金廒*，唐志書，趙步長，王明耿

(1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；3.山東菏澤步長藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000)

丹參藥渣中丹參酮類化學成分的提取富集研究及其利用途徑分析△

戴新新1，沈飛1，宿樹蘭1*，段金廒1*，唐志書2，趙步長3，王明耿3

(1.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；3.山東菏澤步長藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000)

目的：對丹參藥渣中丹參酮類成分的提取富集工藝進行優(yōu)化，并進一步對其開發(fā)利用進行分析。方法：采用L9(34)正交試驗設計，以總丹參酮的含量為評價指標，優(yōu)選丹參藥渣的最佳提取工藝條件；采用溶劑沉淀法純化富集丹參酮類成分。結果：丹參藥渣中丹參酮類成分的最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)為90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次；通過水沉淀法可以去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類化學成分，其中提取物中總丹參酮的含量為1.752%，是原提取物含量的7.5倍。結論：本文優(yōu)選了丹參藥渣中總丹參酮的最佳提取工藝，并采用水沉淀去除部分水溶性成分，從而富集純化丹參酮類成分。建立了采用HPLC同時測定丹參藥渣中總丹參酮含量的方法，操作簡便快速、重現(xiàn)性好，為丹參藥渣的資源化利用及質量控制提供科學依據(jù)與參考。

丹參藥渣；丹參酮；提取制備；純化工藝

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功能[1]。用于瘀血閉阻所致的胸痹及中風、冠心病、心絞痛、心肌梗死等癥的治療[2]。丹參中的資源性化學成分主要包括脂溶性和水溶性成分[1，3]，脂溶性的丹參酮類化合物主要包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等，具有抗氧化[4]、心血管藥理作用[5]、抗菌消炎作用[6]以及抗腫瘤作用[7]等多種生物活性。丹參類注射液制備生產過程主要采用水提醇沉工藝，致使脂溶性成分丹參酮類殘留在藥渣中，未得到充分利用導致丹參資源性化學物質的浪費和資源利用效率低，同時造成環(huán)境污染。該問題已引起政府、相關部門以及從事中醫(yī)藥研究的科技工作者的關注和高度重視。

本文在前期研究基礎上，建立同時測定丹參藥渣中二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的HPLC-PDA分析方法，研究發(fā)現(xiàn)丹參藥渣中殘留大量的丹參酮類資源性化學成分。為了有效利用丹參酮類化學成分，本文采用正交設計法優(yōu)化丹參藥渣中丹參酮類成分的提取工藝條件，以總丹參酮類成分含量為評價指標，明確有利于生產、節(jié)約成本的最佳提取工藝，并采用溶劑沉淀法純化富集丹參酮類成分，為丹參藥渣的資源化利用、利用價值發(fā)現(xiàn)以及資源產業(yè)化奠定基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國 Water 2695 高效液相色譜系統(tǒng)，Water 2998 PDA檢測器，Empower數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)，F(xiàn)W80型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，ML204/02、MS205電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，TDL-80-2B型離心機(上海安亭科學儀器有限公司)，KH-500型超聲波清洗儀器(昆山禾創(chuàng)聲波儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥材

甲醇(南京化學試劑有限公司)、甲酸(MERCK)均為分析純，乙腈(美國TEDIA公司)為色譜純試劑。二氫丹參酮Ⅰ(南京春秋生物工程有限公司，批號：20140516)，丹參酮Ⅰ(批號：110867-200406)、隱丹參酮(批號：110852-200806)和丹參酮ⅡA(批號：110766-200619)購自中國食品藥品檢定研究院，無水碳酸鈉(南京化學試劑有限公司，批號：14042210905)，水為實驗室自制超純水。丹參固體廢棄物在2014年3月收集于菏澤步長制藥有限公司。

2 方法

2.1 試驗設計

根據(jù)預試單因素實驗結果及參考相關文獻[8-10]，對影響丹參酮提取量較大的幾個因素：乙醇用量、乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)、提取時間進行正交試驗設計，以總丹參酮的含量為觀察指標，選擇乙醇用量、提取次數(shù)、提取時間及乙醇體積分數(shù)為考察因素[11]，以L9(34)方法設計正交試驗，因素水平見表1。

表1 丹參酮類成分提取試驗因素水平表

2.2 提取工藝

丹參藥渣(水提后)60 ℃溫度下烘干后，取干燥藥渣打粉，過20 mesh篩，準確稱取丹參藥渣30 g，共計9份，按正交試驗因素水平表條件提取，濾紙過濾得到濾液后濃縮，最終得到干燥固體物，精密稱取適量固體，置500 mL量瓶中，加乙醇溶液溶解至刻度，搖勻，作為供試品溶液，取上清液過0.22 μm的濾膜，進樣。

2.3 純化工藝

2.3.1 丹參藥渣醇提取液的制備 準確稱取丹參藥渣粉末17 g，共計6份，分為3組，每組平行2份，分別為對照組、水沉淀組、碳酸鈉沉淀組，均采用正交試驗中總丹參酮的最佳提取工藝提取，濾紙過濾得到濾液后濃縮，得丹參藥渣濃縮液。

2.3.2 溶劑沉淀法 對照組將濃縮液水浴揮干，在105 ℃干燥 3 h至恒重，精密稱量固形物重量；水沉淀組加適量的超純水，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，濾紙過濾得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密稱量固形物重量；碳酸鈉沉淀組加適量8%碳酸鈉溶液，4 ℃冷藏24 h，使完全沉淀，濾紙過濾得沉淀，在105 ℃干燥3 h至恒重，精密稱量固形物重量。分別精密稱取上述固形物適量，加甲醇溶解并稀釋。取上清液過0.22 μm的濾膜，進樣。計算固形物中指標成分的含量及在固形物中的含量。

2.4 對照品溶液的制備

分別精密稱取二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品適量，用甲醇配成質量濃度分別為0.024 8、0.152、0.209、0.126 mg·mL-1的對照品儲備液。

2.5 色譜條件

色譜柱：BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進樣量：10 μL。以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)為流動相進行梯度洗脫：0～8 min，15%A；8～9 min，15%～28%A；9～20 min，28%A；20～22 min，28%～54%A；22～28 min，54%A；37～38 min，54%～60%A；38～43 min，60%～68%A；43～48 min，68%～70%A；48～52 min，70%～15%A，樣品的HPLC色譜如圖1所示。

注：A.丹參對照品，B.丹參藥渣；1.二氫丹參酮Ⅰ；2.丹參酮Ⅰ；3.隱丹參酮；4.丹參酮ⅡA。圖1 丹參對照品及丹參藥渣的HPLC圖

2.6 方法學考察

2.6.1 標準曲線的繪制 取適量二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品，進樣1、2、5、10、20 μL；按2.5項下色譜條件進樣記錄峰面積積分值。以峰面積積分值A為縱坐標，進樣濃度C為橫坐標，得二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的回歸方程。

2.6.2 重復性試驗 按照2.2項方法制備6份樣品溶液，按2.5項下色譜條件測定二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，計算其RSD。

2.6.3 精密度試驗 連續(xù)進樣對照品液6次，按2.5項下色譜條件測定二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量，計算其RSD。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h進樣，按2.5項下色譜條件每隔4 h，對同一批供試品溶液測定1次，測定6次，計算其RSD值。

2.6.5 回收率試驗 精密稱定已知含量的樣品3份，加入適量對照品，混勻，按照2.2項方法處理，測定有效成分的含量，計算加樣回收率。

2.7 樣品分析測定

精密吸取樣品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，計算樣品中二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量。

3 結果與分析

3.1 方法學考察

通過測定線性關系、穩(wěn)定性、重復性及精密度，對所建立的HPLC-PDA方法進行驗證考察，表2測定結果顯示，所測得化合物其RSD小于5%，回收率在94.63%～102.1%，RSD小于2.23%。以上結果表明本實驗可以用于樣品中這4個丹參酮成分的檢測。

3.2 丹參藥渣中各類成分正交試驗結果

參藥渣中各類成分正交試驗結果見表3。

3.3 總丹參酮的正交試驗結果

總丹參酮的正交試驗結果見表4，方差分析見表5。由結果可知，乙醇含量、提取時間和提取次數(shù)對總丹參酮的提取結果均有統(tǒng)計學差異，其中影響因素由高到低依次為B、D、C、A，最佳水平為A1B2C2D2，乙醇體積分數(shù)為90%，10倍乙醇用量，提取2 h，提取2次。

表2 線性回歸方程、穩(wěn)定性、精密度、重復性和回收率試驗

表3 正交試驗測定丹參廢棄物中丹參酮成分含量 /mg·g-1

表4 總丹參酮正交試驗結果

表5 方差分析

3.4 溶劑沉淀法結果

溶劑沉淀法純化丹參藥渣中丹參酮類成分結果見表6。由結果可知，通過溶劑沉淀法可以去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類化學成分，其中水沉淀法中總丹參酮提取率是原來粗提物含量的7.5倍。

表6 溶劑沉淀法純化丹參藥渣中丹參酮類成分含量 (%)

4 討論

4.1 提取溶劑的選擇

丹參酮類成分為脂溶性成分，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷等有機溶劑，不溶于水，考慮到工業(yè)擴大生產的適用性和可行性，本實驗工藝采用乙醇作溶劑，并優(yōu)化其乙醇濃度，優(yōu)選出經濟實惠的丹參酮類物質提取溶劑。

4.2 提取純化工藝的優(yōu)化

本實驗以總丹參酮為指標，考察其最佳提取工藝，發(fā)現(xiàn)乙醇用量和乙醇濃度是影響提取效果的關鍵因素，最終確定了適應總丹參酮的最佳提取工藝，10倍量的90%乙醇水溶液，提取2次，每次2 h。本實驗通過溶劑沉淀法進一步純化丹參藥渣中的丹參酮類成分，實驗結果表明，水沉淀法可去除丹參粗提物中大多數(shù)的水溶性成分，純化制備丹參酮類化學成分，其中總丹參酮提取率是原來粗提物含量的7.5倍。研究結果為丹參藥渣中丹參酮類資源性化學成分的綜合開發(fā)利用和精細化利用提供了科學依據(jù)，為提升丹參資源的利用效率提供了可行性制備工藝。研究中采用的溶劑沉淀法純化丹參酮類成分后，更有利于其進一步精制制備，以提高丹參酮類成分的純度和利用價值，為丹參藥渣的產業(yè)化及高值化利用提供了研究基礎。

4.3 丹參酮類成分的利用途徑與價值

現(xiàn)代研究表明，丹參酮類成分具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量及抗菌、抗炎等多種生物活性和應用價值，尤其是其在抗腫瘤活性方面尤為突出[12]。郝文慧等[13]研究表明，丹參酮類成分具有顯著的抗腫瘤活性，具有良好的開發(fā)前景。目前含有丹參酮類的藥品也有很多種，主要有丹參酮片、丹參酮膠囊、丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液、丹參酮油膏、丹參舒心膠囊、復方丹參滴丸、丹參舒心片、精制冠心片等[14]。此外，丹參酮類成分在保健產品、化妝品等領域亦顯示出廣泛的應用價值，這將有助于拓展丹參酮類的利用途徑，提升丹參資源的利用效率，有助于丹參酮類資源性化學物質的產品開發(fā)及產業(yè)鏈延伸。同時，丹參資源的綜合利用更有利于生態(tài)效益與社會經濟效益的平衡與協(xié)調發(fā)展。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：76-77.

[2] 錢正清.最新中藥大辭典[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：478-480.

[3] LIU J J，LIN D J，LIU P Q，et al.Induction of apoptosis and inhibition of cell adhesive and invasive effects by salvia in acute promyelocytic leukemia cellsinvitro[J].J Biomed Sci，2006，13(6)：813-823.

[4] DING M，YE T X，ZHAO G R，et al.Aqueous extract ofSalviamiltiorrhizaattenuates increased endothelial permeability induced by tumor necrosis factor-α[J].Int Immunopharmacol，2005，5(11)：1641-1651.

[5] TAKAHASHI K，OUYANG X，KOMATSU K，et al.Sodium tanshinone IIAsulfonate derived from DanShen (Salviamiltiorrhiza) attenuates hypertrphy induced by angiotensin II in cultured neonatal rat cardial cells[J].Biochem Pharmacol，2002，6(4)：745-750.

[6] 杜成友，沈文津，李可洲，等.丹參抗犬感染性休克的作用[J].華西醫(yī)學，1997，12(1)：51.

[7] 葉因濤，徐文清，仲巍.隱丹參酮對宮頸癌Hela細胞增殖及細胞凋亡的影響[J].中國中藥雜志，2010，5(1)：118.

[8] 石嶺，魚紅閃，金鳳燮.丹參藥渣中丹參酮的提取研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38(9)：4539.

[9] 李偉，陳興.丹參中丹參酮ⅡA醇提取工藝研究[J].中國實用醫(yī)藥，2010，5(6)：37.

[10] 陳紅霞，陳芳芳，顏新宇.丹參中丹參酮ⅡA三種提取方法的比較研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2010，4(4)：167.

[11] 劉常青，何百寅，馮峰，等.正交試驗優(yōu)選水提后丹參藥渣中丹參酮ⅡA的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(9)：32-34.

[12] 李建恒，喬亞君，侯力峰，等.丹參脂溶性有效成分丹參酮研究進展[J].河北大學學報(自然科學版)，2015，35(2)：217-224.

[13] 郝文慧，趙文文，陳修平.丹參酮類抗腫瘤作用與機制研究進展[J].中國藥理學通報，2014，30(8)：1041-1044.

[14] 胡榮，羅先欽，勵娜，等.丹參酮緩釋微囊的制備工藝研究[J].中草藥，2012，43(11)：2173-2176.

StudyonEnrichmentofTanshinonesinSalviamiltiorrhizaResiduesandApplicationAnalysis

DAI Xinxin1，SHENFei1，SUShulan1*，DUANJin’ao1*，TANGZhishu2，ZHAOBuchang3，WANGMinggeng3

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang712046，China；3.ShandongBuChangPharmaceuticalCompanyLimited，Heze274000，China)

Objective：To optimize the extraction and enrichment process of tanshinones in the Salvia miltiorrhiza residues. and analysis the development and utilization of Salvia miltiorrhiza residues for further.Methods：The extraction conditions ofSalviadregs was optimized by using the L9(34) orthogonal test，with the amount of total tanshinone as evaluation index.Tanshinones were purified and accumulated by solvent precipitation.Results：The optimum parameters for extraction process of the total tanshinone were as follows：10 times amount of 90% ethanol，extracting for 2 times，each time 2 h.Water precipitation could enrich salvianolic acids.The content of the total tanshinone was 1.752%，7.5 times as in original crude extracts.Conclusion：This paper select the best extracting technology of tanshinones in in the Salvia miltiorrhiza residues, and uses the water precipitation to remove part of the water soluble component, purification and enrichment tanshinones. and established a method for determination of tanshinones from Salvia miltiorrhiza residues in content by HPLC method, and this method is simple, fast and reproducible, and can be a reference for the quality control of the extract of Salvia miltiorrhiza residues.and provide scientific basis and reference for the resource utilization and quality control of Salvia miltiorrhiza residues.

SalviamiltiorrhizaBge.dregs；tanshinones；extraction preparation；purification process

2016-01-13)

江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”資助項目(BRA2015391)；江蘇高校中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心建設重點項目(ZDXM-2-5)

*[通信作者] 宿樹蘭，副教授，研究方向：中藥資源化學與方藥功效物質基礎， E-mail：sushulan@njutcm.edu.cn；段金廒，教授，博士生導師，中國自然資源學會中藥及天然藥物資源研究專業(yè)委員會主任委員，國家“973計劃”項目首席科學家，研究方向：中藥資源化學與資源循環(huán)利用，Tel：(025)85811116，E-mail：dja@njutcm.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.010