HPLC法同時(shí)測(cè)定十味玉泉片中4種有效成分

范桂強(qiáng)，宋更申，張李莉，龐紅霞

(1.河北省衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 053000；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011)

HPLC法同時(shí)測(cè)定十味玉泉片中4種有效成分

范桂強(qiáng)1*，宋更申2，張李莉1，龐紅霞1

(1.河北省衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 衡水 053000；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011)

目的：建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定十味玉泉片中葛根素、甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲4種有效成分的含量。方法：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)(0～8 min在250 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)葛根素，8～14 min在276 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)甘草苷，14～25 min在250 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)甘草酸銨，25～40min在216 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)五味子醇甲)。結(jié)果：4個(gè)有效成分的線性范圍分別為葛根素 68.05～680.5 μg·mL-1(r=0.999 9)、甘草苷22.06～220.6 μg·mL-1(r=0.999 8)、甘草酸銨24.98～249.8 μg·mL-1(r=0.999 4)、五味子醇甲2.184～21.84 μg·mL-1(r=0.998 9)，平均加樣回收率分別為98.83%、97.84%、98.09%、97.20%，RSD分別為0.71%、0.69%、0.80%、0.99%(n=6)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定十味玉泉片中上述4個(gè)有效成分的定量測(cè)定，控制產(chǎn)品質(zhì)量。

高效液相色譜法；十味玉泉片；葛根素；甘草苷；甘草酸銨；五味子醇甲

十味玉泉片由天花粉、葛根、甘草、人參、地黃、麥冬、茯苓、烏梅、黃芪和五味子十味中藥制成，該藥具有止渴生津、清熱除煩、養(yǎng)陰益氣之功能，主治氣陰不足、口渴多飲、消食善饑等糖尿病屬上述證候者?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[1]對(duì)葛根主成分葛根素進(jìn)行了含量控制。處方中甘草[2](主成分甘草苷和甘草酸銨)補(bǔ)脾益氣、清熱解毒；五味子[2](主成分五味子醇甲)收斂固澀、益氣生津。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文采用HPLC法同時(shí)對(duì)上述3種藥材中的4種有效成分進(jìn)行定量研究，此法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為十味玉泉片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DAD檢測(cè)器；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；XS205 DU電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

甘草苷(批號(hào)：111610-201005，含量：94.9%)、甘草酸銨(批號(hào)：110731-201418)、葛根素(批號(hào)：110752-201313，含量：95.8%)、五味子醇甲(批號(hào)：110857-201211，含量：99.9%)均來源于中國食品藥品檢定研究院。十味玉泉片由陜西華西制藥股份有限公司提供，規(guī)格：0.65 g，批號(hào)分別為140601、150122、150428；乙腈為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速:1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～7 min在250 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)葛根素；7～15 min在276 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)甘草苷；15～25 min在250 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)甘草酸銨；25 min在216 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)五味子醇甲；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別稱取葛根素、甘草苷、甘草酸銨、五味子醇甲對(duì)照品適量，置同一容量瓶中，用70%乙醇適量超聲10 min使溶解，并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.272 1、0.088 20、0.100 4、0.008 72 mg·mL-1的混合對(duì)照溶液。取本品除去包衣，研細(xì)，稱取約4片，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲30 min后水浴加熱回流1 h，放冷，補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過。按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL。色譜圖見圖1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.樣品溶液；C.不含葛根樣品溶液；D.不含甘草樣品溶液；E.不含五味子樣品溶液；F.不含葛根、甘草、五味子陰性空白溶液；1.葛根素；2.甘草苷；3.甘草酸銨；4.五味子醇甲。圖1 各組分高效液相色譜圖

葛根素、甘草苷、甘草酸銨、五味子醇甲與相鄰峰分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.04，峰形良好。陰性對(duì)照色譜圖在上述4種成分色譜峰位置處無干擾，理論塔板數(shù)均不低于4000。

2.3 溶液的制備

2.3.1 4種對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取葛根素、甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲對(duì)照品適量，置同一容量瓶中，用70%乙醇適量超聲10 min使溶解，稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為6.805、2.206、2.498、0.218 4 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密量取2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品20片，除去包衣后精密稱定，研細(xì)，稱取約4片量，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲30 min后水浴加熱回流1 h，放冷，補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過。

江寧以悠久的歷史文化與古都風(fēng)貌著稱，是著名的“六朝古都”“十朝都會(huì)”，清朝時(shí)是江南的政治文化中心之一。江寧景觀一級(jí)目錄和二級(jí)目錄的數(shù)量與蘇州相同，帝王陵如明太祖陵，園林如瞻園等，都吸引了康、乾二帝的關(guān)注。

2.3.4 陰性空白對(duì)照溶液的制備 按處方分別配制不含葛根、不含甘草、不含五味子以及不含葛根、甘草、五味子三種藥材的空白制劑，按照供試品溶液的制備方法處理，制成陰性空白對(duì)照溶液。

2.4 檢測(cè)限及定量限

將各對(duì)照品色譜峰測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，分別以信噪比為3∶1及10∶1時(shí)注入液相色譜儀的量確定檢測(cè)限與定量限，見表2。

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各1、2.5、5、7.5、10 mL，分別置于100 mL量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。各吸取10 μL分別注入液相色譜儀，測(cè)定。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程，見表2。結(jié)果表明，葛根素、甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲均在相應(yīng)線性范圍，所測(cè)對(duì)照品的濃度與峰面積存在良好的線性關(guān)系。

表2 4個(gè)對(duì)照組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，以各自峰面積計(jì)算，四種成分的RSD分別為0.32%、0.45%、0.72%、0.56%。表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取批號(hào)為140601的十味玉泉片4 g，共6份，按2.3.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，測(cè)定其含量。葛根素、甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲含量分別為3.252、1.048、1.225、0.106 mg/片，RSD分別為0.44%、0.50%、0.66%、0.63%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、16 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果葛根素、甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲四種成分峰面積的RSD分別為0.70%、0.62%、0.73%、0.94%。表明供試液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：140601，平均片重0.651 2 g)細(xì)粉適量(約為2片)，分別加入含葛根素(6.805 mg·mL-1)、甘草苷(2.206 mg·mL-1)、甘草酸銨(2.498 mg·mL-1)和五味子醇甲(0.218 4 mg·mL-1)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，按2.3.3制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣10 μL，計(jì)算各組分平均回收率。見表3～6。

結(jié)果表明，4種成分的平均回收率均介于95%～105%，符合要求。

表3 葛根素加樣回收試驗(yàn)(n=6)

表4 甘草苷加樣回收試驗(yàn)(n=6)

表5 甘草酸銨加樣回收試驗(yàn)(n=6)

表6 五味子醇甲加樣回收試驗(yàn)(n=6)

2.10 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批次的十味玉泉片，按2.3.3項(xiàng)下供試品的制備方法，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，用外標(biāo)法分別計(jì)算葛根素、甘草苷和甘草酸銨和五味子醇甲的含量。結(jié)果見表7。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果(含量mg/片，n=3)

3 討論

3.1 溶劑與提取方法的確定

比較了甲醇超聲30 min、80%乙醇在80 ℃水浴中回流30 min、70%乙醇水浴回流1 h、50%乙醇水浴回流1 h等，發(fā)現(xiàn)在用70%乙醇水浴回流1 h條件下，甘草苷、甘草酸銨和五味子醇甲提取量最大，雜質(zhì)較少，葛根素在用70%乙醇超聲30 min時(shí)，提取量較大，故而本方法采取70%乙醇作為溶劑，并先超聲再回流的提取方式，取得了滿意效果。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取上述4種成分，用70%乙醇超聲溶解后，利用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描圖，發(fā)現(xiàn)在250 nm處均能有信號(hào)相應(yīng)，葛根素在250 nm、甘草苷在276 nm、甘草酸銨在250 nm、五味子醇甲在216 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，為使各成分都能獲得最大吸收，準(zhǔn)確定量，因此運(yùn)用波長(zhǎng)切換技術(shù)，使各個(gè)組份在其最大吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中，采用甲醇-0.1%枸櫞酸溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水[2-6]等作為流動(dòng)相對(duì)多組分進(jìn)行洗脫，優(yōu)化選擇采用乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，分離良好，操作簡(jiǎn)便。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：WS3-B-3173-98-2009-1[S].北京：國家食品藥品監(jiān)督管理總局，2014.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[3] 王治平，李衛(wèi)民，高英，等.HPLC同時(shí)測(cè)定黃芪葛根湯中9種異黃酮類有效成分[J].中國中藥雜志，2010，35(20)：2689-2692.

[4] 范桂強(qiáng)，柳俊萍，頡維民，等.高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)陰清肺丸中芍藥苷的含量[J].河北中醫(yī)，2012，34(7)：1063-1065.

[5] 單鑫，陸兔林，毛春芹，等.HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方五味含片中葛根素、甘草苷、甘草酸銨、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，30(1)：82-84.

[6] 林雪霞.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定升麻黃芩顆粒中黃芩苷、芍藥苷和葛根素[J].中國藥師，2015，18(3)：485-487.

SimultaneousDeterminationofFourActiveComponentsintheShiweiYuquanTabletsbyHPLC

FAN Guiqiang1*，SONGGengshen2，ZHANGLili1，PANGHongxia1

(1.HengshuiCentreforFoodandDrugControl，Hengshui，Hebei，053000，China；2.HebeiInstituteforDrugControl，Shijiazhuang，Hebei，050011，China)

Objective：To establish an HPLC method for simultaneous determination of four active components(puerarin；liquiritin；ammonium glycyrrhetate；schisandrin)in the Shiwei Yuquan tablets.Methods：Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column was used with mobile phase consisting of water containing 0.1% phosphoric acid and acetonitrile in gradient mode.The flow rate was 1.0 mL·min-1，The column temperature was 30 ℃.Puerarin was detected at 250 nm，liquiritin was detected at 276 nm，ammonium glycyrrhetate were detected at 250nm，and schisandrin was detected at 216 nm.Results：There was good linear relationship between the concentration of puerarin，liquiritin，ammonium glycyrrhetate，schisandrin，and peak area within the concentration range of 68.05-680.5 μg·mL-1(r=0.999 9)，22.06-220.6 μg·mL-1(r=0.999 8)，24.98-249.8 μg·mL-1(r=0.999 4)，2.184-21.84 μg·mL-1(r=0.998 9).The average recovery(RSD)was 98.83%(0.71%)，97.84%(0.69%)，98.09%(0.80%)，97.20%(0.99%)，respectively(n=6).Conclusion：The established method is accurate，highly sensitive and well reproducible，which can be used for the determination of the four active ingredient in the Shiwei Yuquan tablets，control product quality.

HPLC；Shiwei Yuquan tablets；puerarin；liquiritin；ammonium glycyrrhetate；schisandrin

2016-02-18)

*

范桂強(qiáng)，副主任藥師，研究方向：食品、藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究；E-mail：sagefan@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.028