金鐵鎖PtCYP450基因的克隆及原核表達(dá)△

李國(guó)棟，韓麗君，劉小莉，楊耀文，錢(qián)子剛

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

·基礎(chǔ)研究·

金鐵鎖PtCYP450基因的克隆及原核表達(dá)△

李國(guó)棟，韓麗君，劉小莉，楊耀文，錢(qián)子剛*

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

目的：從金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu中克隆細(xì)胞色素PtCYP450酶基因，進(jìn)行序列分析和原核表達(dá)。方法：根據(jù)已獲得的金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)PtCYP450基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，利用RT-PCR方法獲得金鐵鎖PtCYP450基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并進(jìn)行TA克隆、測(cè)序及序列分析；構(gòu)建金鐵鎖PtCYP450-03基因的原核表達(dá)載體pEASY-E1-CYP450，轉(zhuǎn)入BL21(DE3) Chemically Competent Cell中，在ArtMediaTMProtein Expression培養(yǎng)基中進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果：獲得全長(zhǎng)1612 bp的金鐵鎖CYP450 cDNA，其開(kāi)放閱讀框(ORF)為1560 bp，編碼519個(gè)氨基酸；序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，PtCYP450基因?qū)儆贑YP710家族成員。構(gòu)建了pEASY-E1-CYP450重組質(zhì)粒，獲得穩(wěn)定的原核表達(dá)體系，SDS-PAGE結(jié)果表明所表達(dá)的蛋白與預(yù)測(cè)的蛋白大小一致。結(jié)論：成功克隆了金鐵鎖PtCYP450基因，構(gòu)建了穩(wěn)定的pEASY-E1-CYP450原核表達(dá)體系，為進(jìn)一步研究金鐵鎖中三萜皂苷合成代謝途徑及其關(guān)鍵酶表達(dá)模式奠定基礎(chǔ)。

金鐵鎖；PtCYP450；基因克??；原核表達(dá)；序列分析

稀有瀕危物種金鐵鎖PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu為石竹科(Caryophyllaceae)單型屬植物[1]，以根入藥，是“云南白藥”的主要原料藥之一，主治跌打損傷、風(fēng)濕痛、癰疽瘡癤、創(chuàng)傷出血等癥[2]，主要有效成分為金鐵鎖三萜總皂苷[3]。MVA途徑是植物體內(nèi)皂苷合成的主要途徑，在此途徑中有多種酶參與了次生代謝產(chǎn)物的合成及調(diào)控，如法尼基焦磷酸合成酶(FPS)、鯊烯環(huán)氧酶(SE)、鯊烯合成酶(SS)等都為三萜皂苷碳骨架形成相關(guān)的關(guān)鍵酶，它們的含量及表達(dá)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的含量有重要影響[4-10]。三萜類(lèi)骨架合成后，依賴(lài)細(xì)胞色素P450單加氧酶及糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)萜類(lèi)骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，最終獲得各種各樣的三萜皂苷產(chǎn)物。細(xì)胞色素P450單加氧酶系廣泛分布于生物有機(jī)體內(nèi)，參與了許多重要的生命過(guò)程，它在植物次生代謝產(chǎn)物的合成途徑中起到氧化作用，并在調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起到重要作用[11-14]。本研究根據(jù)已獲得的金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞色素P450單加氧酶基因序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物，從金鐵鎖中成功提取了RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并擴(kuò)增出金鐵鎖P450基因全長(zhǎng)cDNA序列，測(cè)序及序列分析后進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)，結(jié)果表明所構(gòu)建的P450原核表達(dá)載體在大腸桿菌中成功表達(dá)目的蛋白。本研究為進(jìn)一步研究金鐵鎖中三萜皂苷合成代謝途徑中關(guān)鍵酶表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步確定和研究與金鐵鎖三萜皂苷合成代謝途徑相關(guān)的P450提供參考，也為其他生物中P450的研究提供參考。

1 材料與試劑

金鐵鎖Psammosilenetunicoides植株采自云南省大理市鶴慶縣馬場(chǎng)，栽培于云南中醫(yī)學(xué)院優(yōu)良種苗繁育工程中心實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)材料為金鐵鎖根部。

質(zhì)粒pEASY-T1 Vector、pEASY-E1Expression Vector、菌株DH5α、BL21(DE3)、ArtMediaTMProtein Expression(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Takara Minibest Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)；一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒、引物合成和序列測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；常用試劑及耗材(昆明鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 金鐵鎖總RNA的提取及PtCYP450基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增

按照Takara Minibest Universal RNA Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取金鐵鎖總RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?；按照PrimeScriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成金鐵鎖第一鏈cDNA。根據(jù)金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組中的一條PtCYP450序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異擴(kuò)增引物。正向引物：5′-ATGAACACATCAGAAATCTGGG-3′；反向引物：5′-TCAGTCAAAGGAGAGAGGAAGAG-3′。采用25 μL反應(yīng)體系，以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并純化，測(cè)序得到DNA序列信息。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線Blastx分析，DNAman軟件尋找該基因的ORF。分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建用MEGA6.0軟件完成，選擇鄰接法，應(yīng)用自舉檢驗(yàn)1000次。

2.2 PtCYP450基因的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)捷瑞PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收并純化擴(kuò)增的片段，將4 μL擴(kuò)增出的目的片段PtCYP450插入1 μL pEASY-T1載體中進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白色菌落培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后將陽(yáng)性克隆送測(cè)序鑒定，提取陽(yáng)性單克隆菌株質(zhì)粒。將4 μL擴(kuò)增出的PtCYP450目的片段插入1 μL pEASY-E1表達(dá)載體中進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆進(jìn)行PCR以鑒定陽(yáng)性克隆，挑選正確表達(dá)方向的陽(yáng)性克隆，200 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)6 h，用試劑盒提取質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆?，獲得表達(dá)載體pEASY-E1-P450。

2.3 PtCYP450基因的原核表達(dá)

用所獲得的表達(dá)載體pEASY-E1-P450轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌涂布于含有50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆，按照ArtMediaTMProtein Expression說(shuō)明書(shū)加入適量體積的ArtMedia培養(yǎng)基內(nèi)，250 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)以相同條件的pEASY-E1空載體的轉(zhuǎn)化菌作為對(duì)照。收集菌液并根據(jù)一步法細(xì)菌活性蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白提取，分別收集上清液和沉淀蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆?。? μL沉淀與12 μL上清液混勻，加入4 μL蛋白上樣Buffer，100 ℃、5 min變性。將20 μL樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(5%的濃縮膠和10%的分離膠)電泳測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 金鐵鎖PtCYP450基因的擴(kuò)增與克隆

提取金鐵鎖總RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所獲RNA條帶清晰(見(jiàn)圖1)，紫外分光光度計(jì)分析顯示A260/A280=1.96。表明所獲得的金鐵鎖RNA純度較好，可以用于擴(kuò)增基因全長(zhǎng)。將RNA反轉(zhuǎn)為第一鏈cDNA，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增全長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大小約為1600 bp的條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期的目的片段一致。

注：M.DL2000；1、2.金鐵鎖RNA；3、4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 金鐵鎖總RNA提取 及CYP450基因擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后利用Sequencher 4.14軟件進(jìn)行序列拼接，得到1612 bp的序列，開(kāi)放閱讀框1560 bp，編碼519個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量約為60 kD。在NCBI上進(jìn)行BLast比對(duì)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的查閱[15]，篩選出包括金鐵鎖PtCYP450在內(nèi)的17條屬CYP710家族參與三萜皂苷生物合成的P450氨基酸序列。PtCYP450的核酸序列與其他植物的CYP450 710A1基因序列同源性為90%～70%，所編碼的蛋白與其他植物(甜菜、葡萄、苜蓿等)CYP450 710A1基因編碼的蛋白同源性高達(dá)98%～87%。使用MEGA6.0進(jìn)行多序列的比對(duì)，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行聚類(lèi)分析，金鐵鎖PtCYP450與豆科的5個(gè)物種、十字花科的3個(gè)物種以及葡萄形成姐妹群，表明它們間親緣關(guān)系較近(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明克隆出的金鐵鎖PtCYP450基因?qū)儆贑YP450 710亞家族。

圖2 PtCYP450與其他物種CYP450 710家族氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)分析

3.2 金鐵鎖PtCYP450基因的表達(dá)載體構(gòu)建與蛋白表達(dá)

用擴(kuò)增出的目的片段CYP450與 pEASY-T1載體的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。將轉(zhuǎn)化菌涂布于LB平板上培養(yǎng)，挑取白色菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證后將陽(yáng)性克隆送測(cè)序鑒定，并提取質(zhì)粒。根據(jù)pEASY-E1Expression Vector的構(gòu)建圖譜，利用CYP450目的片段與pEASY-E1構(gòu)建原核表達(dá)載體pEASY-E1-CYP450，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR與測(cè)序后確定目的片段連接上了pEASY-E1載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)后用ArtMedia培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定，所表達(dá)的蛋白大小與預(yù)測(cè)蛋白大小一致(見(jiàn)圖3)，且pEASY-E1空載體轉(zhuǎn)化菌對(duì)照組在預(yù)測(cè)位置并沒(méi)有明顯表達(dá)蛋白，因此認(rèn)為金鐵鎖CYP450基因原核表達(dá)成功。

注：M.蛋白Maker；1.pEASY-E1空載體對(duì)照；2.pEASY-E1-P450。圖3 SDS-PAGE電泳圖

3.3 金鐵鎖PtCYP450編碼蛋白特性分析

利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具ProtParam (http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)分析金鐵鎖CYP450基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)結(jié)果如下：金鐵鎖CYP450基因編碼編輯519個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為60 kD，理論等電點(diǎn)值(pI)為6.58，總共包括8400個(gè)原子，分子式為C2720H4183N713O759S25，在這個(gè)CYP450蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，達(dá)到11.4%，而色氨酸(Trp)所占比例最低，均為1.5%；正電荷殘基總數(shù)為59，負(fù)電荷殘基總數(shù)為61。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為41.57，脂肪指數(shù)為86.99，總平均親水性為-0.158。表明這是一個(gè)不穩(wěn)定蛋白。

利用NPS@server在線軟件分析預(yù)測(cè)金鐵鎖CYP450編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，在CYP450蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，α-螺旋(Hh)占46.24%，β-折疊(Ee)占6.17%，無(wú)規(guī)則卷曲占45.28%。利用SMART服務(wù)器分析金鐵鎖CYP450編碼蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，從分析結(jié)果可知，金鐵鎖CYP450編碼蛋白結(jié)構(gòu)中，15～34位氨基酸間是一個(gè)跨膜螺旋區(qū)，第46～494位是細(xì)胞色素P450酶結(jié)構(gòu)域，表明PtCYP450蛋白具有P450超家族結(jié)構(gòu)域(見(jiàn)圖4)。

圖4 金鐵鎖CYP450編碼蛋白的結(jié)構(gòu)功能域示意圖

利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)對(duì)金鐵鎖PtCYP450編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 金鐵鎖CYP450編碼的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

4 討論

在自然界中，很多具有重要價(jià)值的三萜皂苷產(chǎn)量較低，利用栽培措施大幅度提高產(chǎn)量或利用化學(xué)合成藥用活性部分難度都很大。如果從分子水平上對(duì)其生物合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行研究調(diào)控，促進(jìn)表達(dá)，能夠提高目標(biāo)產(chǎn)物的量，產(chǎn)生良好的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益。目前，通過(guò)生物工程調(diào)控表達(dá)各種次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶的技術(shù)已日漸成熟，且取得了重大進(jìn)展，是當(dāng)前研究功能基因的熱點(diǎn)，采用生物技術(shù)來(lái)緩解資源短缺等問(wèn)題是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的主要目的之一。

細(xì)胞色素P450單加氧酶系廣泛分布于生物有機(jī)體內(nèi)，是動(dòng)植物生命過(guò)程重要的酶，在植物萜類(lèi)生物合成過(guò)程中，CYP450家族成員起著十分重要的作用[15-17]。CYP450對(duì)三萜碳環(huán)骨架合成起著羥基化和氧化等一系列復(fù)雜的修飾作用，是三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。近年來(lái)，由于二代高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于RNA-Seq的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為研究藥用植物功能基因提供了便利。本研究通過(guò)前期獲得的金鐵鎖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首次從中成功克隆出了金鐵鎖的CYP450基因，并進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析，以及構(gòu)建了原核表達(dá)載體pEASY-E1-CYP450，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，成功誘導(dǎo)表達(dá)出PtCYP450蛋白。根據(jù)氨基酸序列相似性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，可將CYP450分為不同的家族和亞家族。本文所克隆出的金鐵鎖PtCYP450的核酸序列與其他植物的CYP450 710A1基因序列同源性為90%～70%，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果，初步確定其為CYP450 710亞家族。該研究為下一步確定參與金鐵鎖三萜皂苷合成代謝的CYP450s以及進(jìn)行生物功能驗(yàn)證分析奠定基礎(chǔ)，也將有助于深入研究金鐵鎖中三萜皂苷生物合成代謝途徑。

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CloningandProkaryoticExpressionofPtCYP450GeneinPsammosilenetunicoides

LIGuodong，HANLijun，LIUXiaoli，YANGYaowen，QIANZigang*

(YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650500，China)

Objective：To obtain the key enzyme genePtCYP450 involving in the triterpenesaponins biosynthesis，aPtCYP450 gene was cloned fromPsammosilenetunicoidesand prokaryotic expression were performed.Methods：According toone of thePtCYP450 gene sequences of transcriptome ofP.tunicoides，a pair of primers were designed，and the ORF (Open readingframe)of cDNA sequences was obtained by RT-PCR.Then TA cloning，sequencing，and sequence analysis were performed.Prokaryoticexpression vector pEASY-E1-CYP450was constructed and transformed intoE.coliRosetta (DE3) for the expression under theinduction of Isopropyl ArtMediaTMProtein Expression.Results：The ORF ofGrCYP450 has a length of 1560 bp coding for 519amino acids.Sequence analysis andphylogenic analysis showed thatPtCYP450 was the member of CYP710subfamily.The SDS-PAGE results showed that the expressed proteins were consistent with theanticipated size.Conclusion：ThePtCYP450 gene is successfully cloned，and the stable prokaryotic expression system is established.This study will provide a foundation for the further purification，structural and functional researches of CYP450 protein.

PsammosilenetunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu；PtCYP450；gene cloning；prokaryotic expression；sequence analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.015

2016-01-04)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260609，81560613)；云南省自然科學(xué)基金[2014FD035，2015FB205(-015)]；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目 (2060302)

*

錢(qián)子剛，教授，研究方向：中藥資源學(xué)；Tel：(0871) 65918214，E-mail：qianzig@aliyun.com