大田生產(chǎn)中鹽脅迫對(duì)五味子木脂素類成分的影響研究△

李先寬，鄭艷超，張堅(jiān)，王海英，王麗芝，馬琳

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193)

·中藥農(nóng)業(yè)·

大田生產(chǎn)中鹽脅迫對(duì)五味子木脂素類成分的影響研究△

李先寬，鄭艷超，張堅(jiān)，王海英，王麗芝，馬琳*

(天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193)

目的：研究五味子大田生產(chǎn)中連續(xù)兩年鹽脅迫對(duì)五味子藥材中木脂素類成分的影響。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定12個(gè)不同采收期、5個(gè)氯化鈉處理水平下共54份樣品中6種木脂素含量。結(jié)果：鹽脅迫在0～0.030 kg·m-2范圍內(nèi)五味子植株能正常生長；0.012 kg·m-2氯化鈉處理水平脅迫有利于五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的積累，而0.030 kg·m-2氯化鈉處理水平對(duì)最佳采收期五味子果實(shí)中6種木脂素類成分含量有一定的抑制作用。結(jié)論：本研究為研究藥用植物五味子的引種和抗逆馴化可提供參考依據(jù)。

五味子；鹽脅迫；大田生產(chǎn)；五味子醇甲

五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz) Baill.的干燥成熟果實(shí)，味酸、辛、微苦，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心等功效[1]。當(dāng)今土壤鹽堿化和次生鹽堿化問題在世界范圍內(nèi)廣泛存在，特別是在干旱、半干旱地區(qū)，問題更為嚴(yán)重[2]。本研究對(duì)大田生長的五味子連續(xù)兩年實(shí)施不同濃度鹽脅迫處理，研究不同鹽脅迫水平對(duì)不同生長期的五味子木脂素類有效成分積累過程的作用。本研究通過測(cè)定12個(gè)不同采收期、5個(gè)氯化鈉處理水平下的共54份五味子樣品中6種木脂素含量，嘗試性探索鹽脅迫下不同采收期五味子木脂素含量的變化規(guī)律，以期為進(jìn)一步闡述鹽脅迫對(duì)五味子品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料

鹽脅迫試驗(yàn)于2012年5月至2014月1月在遼寧省蓋州市高屯鎮(zhèn)高屯村五味子試驗(yàn)田進(jìn)行，試驗(yàn)組面積為100 m2，行距為1.2 m，株距為0.5 m，共約五味子植株180株，試驗(yàn)田管理水平較好，排灌方便。選擇長勢(shì)較一致的四年生五味子進(jìn)行脅迫試驗(yàn)。試驗(yàn)材料為五味子的果實(shí)，采集時(shí)間為2013年6月到2014年1月，自然陰干，粉碎，見表1。試驗(yàn)分別于2012年和2013年五月中旬、六月下旬進(jìn)行鹽脅迫，施于植株下方距地表16到26 cm深處。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)5個(gè)處理。處理1為氯化鈉0.012 kg·m-2處理組，處理2為0.018 kg·m-2處理組，處理3為0.024 kg·m-2處理組，處理組4為0.030 kg·m-2處理組，處理5為空白組。土施氯化鈉前，應(yīng)用“重量法”對(duì)樣地土壤中可溶性鹽分的總量進(jìn)行了測(cè)定，20～30 cm土層土壤全鹽含量平均值為0.9 g·kg-1。土施后，隨即用水淋洗苗木并使氯化鈉溶解后隨水分下滲到苗木根部土層中。

儀器：ShimadzuLC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，AT-130柱溫(大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司)FA2004A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，KH3200B超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，HC-150T2粉碎機(jī)(永康市綠可食品機(jī)械有限公司)。

試劑：對(duì)照品五味子醇甲(110857-200507)(2014年購自中國食品藥品檢定研究院)，五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(2014年購自成都思科華生物技術(shù)有限公司)。對(duì)照品純度均≥98%。甲醇為色譜純和分析純，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

表1 大田生產(chǎn)中鹽脅迫所得五味子樣品

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)梯度洗脫，洗脫條件為：0～12 min，B：50；12～20 min，B：50～60；20～25 min，B：60～70；25～32 min，B：70～75；32～37.5 min，B：75～50。檢測(cè)波長220 nm，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。高效液相色譜圖對(duì)照品見圖1A，供試品圖1B。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素適量，加甲醇溶解制成每1 mL含五味子醇甲0.184 8 mg、五味子醇乙0.185 6 mg、五味子酯甲0.195 6 mg、五味子甲素0.204 0 mg、五味子乙素0.198 0 mg、五味子丙素0.183 2 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取干燥后的五味子果實(shí)樣品粉末(40目)0.25 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，精密加入甲醇23 mL，稱重，超聲提取(功率250 W，頻率kHz)30 min，取出，加甲醇至刻度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果與分析

五味子樣品木脂素類指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果見表2，根據(jù)指標(biāo)成分含量得五味子木脂素類成分積累趨勢(shì)圖，見圖2。

注：1.五味子醇甲(schisandrin)；2.五味子醇乙(schisandrol B)；3.五味子酯甲(schisantherin A)；4.五味子甲素(deoxyschisandrin)；5.五味子乙素(schisandrin B)；6.五味子丙素(schisandrin C)圖1 五味子對(duì)照品(A)和五味子樣品(B)HPLC圖

采收日期(年?月?日)處理水平五味子醇甲五味子醇乙五味子酯甲五味子甲素五味子乙素五味子丙素2013?06?14空白對(duì)照0 42620 13650 04300 20580 22830 037810 81240 22130 05690 21190 45040 040120 79340 20560 05000 17710 43340 038730 75530 26190 04800 14840 33850 027540 72260 24590 04340 13570 31050 25082013?06?27空白對(duì)照4 73330 43100 19612 14873 39730 406716 12070 98030 24332 02343 34850 467125 96691 04120 23770 79332 21910 166034 20110 74370 14770 75331 39810 204044 00370 99140 10121 00600 12890 39772013?07?22空白對(duì)照4 45280 42000 16771 20571 74780 137916 25731 30560 34951 45622 40820 301926 03421 11040 25031 28692 28010 294235 86251 03330 19921 12702 24550 259344 02900 83990 04921 47972 00900 34522013?08?22空白對(duì)照2 20400 28510 07840 55690 77830 108913 10600 48380 08270 58641 18510 117322 67980 36010 09120 42600 59130 035032 15460 29710 04700 42140 69870 10294??????2013?08?31空白對(duì)照2 51540 30750 13730 45260 85160 033912 93410 49220 18090 48020 99320 056722 74650 28670 16420 39910 54650 03073??????42 13070 46550 03010 84231 09990 1943

表2(續(xù))

注：“*”代表樣品缺失。

注：A.五味子醇甲；B.五味子醇乙；C.五味子酯甲；D.五味子甲素；E.五味子乙素；F.五味子丙素圖2 五味子指標(biāo)成分積累趨勢(shì)

3.1 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子醇甲含量的影響

五味子甲醇含量見表2，采收期2013-06-14樣本各個(gè)水平氯化鈉脅迫處理組五味子甲醇含量較其他采收期含量最低。從采收期2013-06-27到2013-07-22五味子甲醇含量迅速達(dá)到高峰，到八月中旬五味子甲醇含量降低后期含量基本穩(wěn)定。從圖2A中可看出同一采收期5個(gè)不同處理水平，氯化鈉0.012 kg·m-2處理組與空白組相比均有促進(jìn)五味子醇甲含量的作用，而其他處理組不同采收期對(duì)五味子醇甲含量有的促進(jìn)，有的抑制。氯化鈉0.030 kg·m-2處理組除采收期2013-06-14和2013-09-20外其他時(shí)間均有一定的抑制作用。

3.2 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子醇乙含量的影響

五味子醇乙含量見表2，從空白處理組可以看出采收期2013-06-14五味子醇乙含量最低，其余采收期五味子醇乙含量變化不大，到八月底五味子醇乙含量基本穩(wěn)定。而不同氯化鈉脅迫處理組五味子醇乙含量變化差異較大。從圖2B中可看出，各個(gè)氯化鈉脅迫處理組在采收期2013-06-27和2013-07-22五味子醇乙含量積累最快達(dá)到最大值，后期含量降低最后趨于穩(wěn)定。

3.3 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子酯甲含量的影響

五味子酯甲含量見表2，從空白處理組可以看出采收期2013-06-14五味子酯甲含量最低，采收期2013-06-27和2013-07-22五味子酯甲含量較其他采收期含量較高，采收期2013-08-22五味子酯甲含量降低到達(dá)第二最低值，而其余采收期五味子酯甲含量又有所升高。采收期從2013-06-14到2013-08-31氯化鈉0.012 kg·m-2處理組與空白組相比均能促進(jìn)五味子酯甲含量增加。氯化鈉脅迫其他處理水平各個(gè)采收期大部分有一定的抑制作用，但是抑制含量變化程度不同。

3.4 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子甲素含量的影響

五味子甲素含量見表2，從空白處理組可以看出除采收期2013-06-14五味子甲素含量最低，采收期2013-06-27和2013-07-22五味子甲素含量較其他采收期含量較高，其余采收期五味子甲素含量變化不顯著。從圖2D中可看出，不同采收期各個(gè)氯化鈉脅迫處理組對(duì)五味子甲素含量變化影響無較明顯規(guī)律。

3.5 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子乙素含量的影響

五味子乙素含量見表2，從空白處理組可以看出五味子乙素含量趨勢(shì)與五味子甲素空白處理組趨勢(shì)幾乎一致。氯化鈉0.012 kg·m-2處理組與空白組相比均有促進(jìn)五味子乙素含量的作用。從采收期分析，2013-09-20之后的采收期氯化鈉0.030 kg·m-2處理組抑制五味子乙素的積累。另外兩個(gè)氯化鈉脅迫處理組對(duì)五味子乙素含量積累作用沒有顯著規(guī)律。

3.6 不同采收期不同處理水平鹽脅迫對(duì)五味子丙素含量的影響

五味子丙素含量見表2，除2013-09-20采收期外，氯化鈉0.012 kg·m-2處理組與空白組相比均有一定的促進(jìn)五味子丙素含量的作用。與其他木脂素類成分不同，空白處理組在采收期2013.08.31五味子丙素含量最低。

4 討論

《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定五味子藥材的檢測(cè)成分為五味子醇甲，2013年10月12日采收的五味子樣品，鹽脅迫處理組2樣品中五味子醇甲含量為0.889 8 mg·g-1，而高濃度組3為2.848 9 mg·g-1，低濃度組為3.661 7 mg·g-1，數(shù)據(jù)差距較大。分析原因?yàn)辂}脅迫組2樣品采收后，未及時(shí)自然陰干，導(dǎo)致樣品發(fā)霉，烘箱烘干樣品過程中，部分樣品被烘焦，可能導(dǎo)致五味子醇甲含量偏低，具體原因有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

鹽脅迫對(duì)五味子木脂素成分含量和產(chǎn)量的影響 氯化鈉0.012 kg·m-2處理組對(duì)12個(gè)不同采收期五味子木質(zhì)素成分積累有一定的促進(jìn)作用。由于木脂素類成分是次生代謝產(chǎn)物，是植物在逆境條件下為了更好的適應(yīng)生存而形成的特殊保護(hù)代謝物質(zhì)[3]。氯化鈉0.030 kg·m-2處理組對(duì)最佳采收期五味子果實(shí)中木脂素類成分含量有一定的抑制作用。鹽脅迫會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生離子脅迫，即離子毒害作用[4]，五味子植株在低、中水平鹽脅迫下表現(xiàn)為生長減緩，枝葉與空白對(duì)照組相比生長不旺盛，同時(shí)鹽脅迫實(shí)驗(yàn)組的五味子果穗較稀疏，單果粒普遍較小，且果粒表面不光滑，果實(shí)產(chǎn)量較對(duì)照組偏低。

五味子植株鹽脅迫耐受量 本試驗(yàn)于2012年五月中旬對(duì)五味子植株進(jìn)行了第一次脅迫處理，當(dāng)鹽脅迫量為1.92 kg，高水平脅迫2天后，發(fā)現(xiàn)高水平處理組中的大部分五味子植株發(fā)生了五味子葉皺縮卷曲、變黃、脫落等現(xiàn)象。鹽脅迫的濃度太高可能打破了植物體內(nèi)的離子平衡，造成了離子平衡的破壞和滲透脅迫等原初效應(yīng)，引起離子毒害和礦質(zhì)營養(yǎng)缺乏而后導(dǎo)致過氧化傷害等次生脅迫效應(yīng)[5-6]。從保護(hù)五味子植株的角度出發(fā)，取消了對(duì)五味子植株高水平脅迫的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明0.096 kg·m-2的鹽脅迫量可能超過了五味子正常生長的閾值，研究五味子的鹽脅迫問題有助于人們認(rèn)識(shí)五味子對(duì)環(huán)境的應(yīng)激與適應(yīng)機(jī)制，探索高鹽環(huán)境中的五味子的改良、遺傳育種等方法。近而為研究藥用植物五味子的引種和抗逆馴化提供依據(jù)。

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EffectofSodiumChlorideStressonLignansContentofSchisandrachinensisFruitsinFieldProduction

LIXiankuan，ZHENGYanchao，ZHANGJian，WANGHaiying，WANGLizhi，MALin*

(TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China)

Objective：To study the effect of field production sodium chloride stress on the effective components of lignans contents ofSchisandrachinensisfruits in two years.Methods：The HPLC was used to determine the 54 samples of 12 different harvest periods and sodium chloride stress on five different processing levels ofS.chinensissix lignan content.Results：S.chinensisgrew normally under sodium chloride stress at the range of 0～0.030 kg·m-2，0.012 kg·m-2sodium chloride level stress was of benefit to the schisandrin，schisandrolB，schisantherin A，deoxyschisandrin，schisandrin B and schisandrin C pigment accumulation.Sodium chloride 0.030 kg·m-2treatment decreased six lignan components content in the fruits ofS.chinensis.Conclusion：This study provides a reference for the application of introduction and domestication of resilience onS.chinensisin field production.

Schisandrachinensis；sodium chloride stress；field production；schisandrin

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.6.019

2016-03-30)

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目(2060302)

*

馬琳，教授，研究方向：中藥資源與中藥生物工程；E-mail：malin7983@163.com