生石花種子萌發(fā)及幼苗生長最優(yōu)條件的篩選

范麗楠，張宗申，劉平武*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧 530004;2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

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生石花種子萌發(fā)及幼苗生長最優(yōu)條件的篩選

范麗楠1，張宗申2，劉平武1*

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗室，廣西南寧 530004;2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034)

[目的]優(yōu)化生石花種子萌及幼苗生長的條件，以提高其種子萌發(fā)率。[方法]采用MS、1/2MS、3/4MS等培養(yǎng)基為生石花生長基質(zhì)，比較不同培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率和幼苗生長情況，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行光照時間、激素配比和浸泡時間的篩選。[結(jié)果]1/2MS培養(yǎng)基最適合生石花種子萌發(fā)及幼苗生長。16 h為最優(yōu)光照時間；不同因素影響由大到小依次為浸泡時間、GA濃度、IAA濃度、NAA濃度及6-BA濃度。其中，GA濃度與浸泡時間對種子萌發(fā)有顯著影響，且0.1 mg/mL的GA濃度以及4 h的浸泡時間為最優(yōu)組合。[結(jié)論]該研究為生石花組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

生石花；培養(yǎng)基；種子萌發(fā)；激素；光照時間

生石花(Lithops)是番杏科生石花屬多年生小型肉質(zhì)植物，未開花前的形態(tài)像石頭半埋在地下，又名石頭花。因其形態(tài)獨(dú)特，色彩斑斕，株型小巧，高度肉質(zhì)，葉形、葉色、花色都富于變化，而栽培又有一定難度，成為目前很受歡迎的觀賞性植物[1]。生石花主要產(chǎn)于南非和納米比亞的溫暖、干旱和陽光充足的地區(qū)，生長適宜溫度為20～24 ℃[2-4]。

生石花作為多肉植物的一種，其繁殖方式以種子繁殖為主，很少采用分株無性繁殖。生石花的種子細(xì)小，直徑一般為0.1～0.5 mm。除種子發(fā)芽力、休眠期外，空氣、水分、溫度等外部環(huán)境條件是種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素[5]。添加植物激素如細(xì)胞分裂素、吲哚乙酸、赤霉素等對種子萌發(fā)也有較好的促進(jìn)作用，此外有些種子的萌發(fā)還受到光照的影響[6-8]。自植物組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在作物、花卉、藥用植物等脫毒、快繁方面得到了廣泛應(yīng)用[9-10]。筆者優(yōu)化不同培養(yǎng)基類型、激素成分及光照等生石花種子萌發(fā)的條件，以期為后續(xù)生石花組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料生石花種子購自某市場。將種子進(jìn)行分裝，50顆一份裝入1 mL離心管中，共39份。

1.2試驗方法

1.2.1種子表面消毒。將燒杯、槍頭、無菌水等滅菌后與生石花種子、培養(yǎng)基等一起置于超凈工作臺紫外殺菌30 min后，按以下步驟進(jìn)行種子表面消毒：無菌水沖洗3次→70%乙醇浸泡30 s→無菌水沖洗3次→升汞消毒液浸泡10 min→無菌水沖洗4～5次備用。

1.2.2不同培養(yǎng)基種子的萌發(fā)差異。采用MS[11]、1/2 MS、3/4 MS和B5[12]4種培養(yǎng)基，以蛭石為基質(zhì)作為對照組，進(jìn)行種子萌發(fā)差異研究。分別配制500 mL 4種培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基中均添加25 g/L白砂糖和5 g/L瓊脂，pH 5.8。高溫高壓滅菌20 min，每種培養(yǎng)基倒15個平板，靜置1 d后備用[13]。

從分好的種子中取出10管，共500粒種子，2管一組，其中一組100粒播種至基質(zhì)中。各培養(yǎng)基分別選10個平板，利用移液器吸頭吸取消毒處理過的生石花種子，均勻接種至培養(yǎng)基上，每個平板接種10～20粒種子，接種后置于25 ℃培養(yǎng)室。

1.2.3不同光照時間種子的萌發(fā)差異。利用1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行光照試驗，將光照培養(yǎng)室內(nèi)溫度設(shè)定為25 ℃，保持24 h光照。各處理用報紙遮蓋以控制光照時間，光照時間分別為0、8、16、24 h。

1.2.4不同激素及濃度浸泡處理種子的萌發(fā)差異。將IAA、GA、NAA、6-BA[14-16]4種不同激素按0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL 5種不同濃度水平及浸泡1、2、4、8、10 h不同時間水平進(jìn)行正交試驗(表1)。每種處理浸泡1份生石花種子，以種子萌發(fā)率為指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)分析不同培養(yǎng)基因素、不同光照因素處理后1～3 d每天記錄種子萌發(fā)率，其后每3 d記錄一次，共記錄至第30天，第30天測量根長、莖的高度以及直徑作為判斷生長情況的指標(biāo)。生石花種子萌發(fā)率計算公式：

萌發(fā)率=( 測定時間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/播種種子總數(shù))× 100%

(1)

發(fā)芽勢=(日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))× 100%

(2)

運(yùn)用WPS2016(金山)對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和做圖，SAS 9.1.3(SAS Institute)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析并對平均數(shù)進(jìn)行比較(新復(fù)極差法-Duncan’s法)。

表1　正交試驗設(shè)計

2　結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對生石花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.1.1不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率的影響。由圖1和表2可知，各處理種子萌發(fā)率趨勢大致相同，生石花種子在第3天左右開始陸續(xù)萌發(fā)，到第18天萌發(fā)率趨于平穩(wěn)。由最終萌發(fā)率(第30天)可見，使用培養(yǎng)基作為基質(zhì)生石花的萌發(fā)率均高于對照。各培養(yǎng)基萌發(fā)率以1/2 MS培養(yǎng)基最高，為88%，其他依次為3/4 MS(83%)、MS(80%)、B5(78%)、對照(68%)。而對于使用相同的MS培養(yǎng)基作為萌發(fā)基質(zhì)，其

濃度越稀，萌發(fā)率越高，高濃度MS培養(yǎng)基相對低濃度MS培養(yǎng)基對生石花的萌發(fā)存在抑制作用。B5培養(yǎng)基在播種3 d左右萌發(fā)率高于其他培養(yǎng)基，但約第12天后萌發(fā)率增長減緩并趨于平穩(wěn)，導(dǎo)致1/2 MS培養(yǎng)基在第5～6天超過B5培養(yǎng)基，3/4 MS培養(yǎng)基在第10～11天超過B5培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基在約第19天超過B5培養(yǎng)基。

此外，利用培養(yǎng)基萌發(fā)普遍比對照萌發(fā)速度快、生長整齊度較好，1/2 MS培養(yǎng)基的種子萌發(fā)率最優(yōu)，整體高于其他培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基在第9天萌發(fā)速率最高，以1/2 MS發(fā)芽勢最高，B5和3/4 MS次之，對照最低。

圖1　不同培養(yǎng)基對生石花種子萌發(fā)率的影響Fig.1　Effects of culture medium on the germination rate of Lithops seeds

培養(yǎng)基種類Mediumtype萌發(fā)率Germinationrate∥%發(fā)芽勢Germinationenergy∥%根長Rootlength∥mm苗高Seedlingheight∥mm莖直徑Stemdiameter∥mmB5785719.19Aa3.703.43MS80397.53Cc2.752.931/2MS886514.51ABb4.083.453/4MS835610.93BCbc2.913.11對照CK683414.13ABb4.003.49

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05); different capital letters indicated extremely significant differences(P<0.01).

2.1.2不同培養(yǎng)基對生石花幼苗生長的影響。培養(yǎng)基類型對生石花生長的影響主要表現(xiàn)為對根長的影響，對苗高及莖直徑則無顯著影響。方差分析結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對生石花根的生長有極顯著差異，B5培養(yǎng)基中生石花幼苗的平均根長最長，且與1/2 MS和對照差異顯著，與3/4MS和MS培養(yǎng)基差異極顯著(表2)。觀察發(fā)現(xiàn)，對照組、1/2 MS培養(yǎng)基以及B5培養(yǎng)基中幼苗根部的須根較多，表明1/2 MS及B5培養(yǎng)基較適合生石花生根并吸收營養(yǎng)。

綜上，1/2MS培養(yǎng)基最利于生石花種子萌發(fā)，對其根系發(fā)育也有較好的促進(jìn)作用，B5培養(yǎng)基則有利于生石花根系的發(fā)育。

2.2光照時間對生石花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.2.1光照時間對種子萌發(fā)的影響。由表3可知，光照時間對種子萌發(fā)的影響較小，不同光照時間的種子萌發(fā)率均在74%～80%，當(dāng)光照時間增加至16 h時種子萌發(fā)率最高為80%，而24 h時萌發(fā)率最低為74%。

2.2.2光照時間對幼苗生長的影響。由表3可知，光照時間對生石花根的生長無顯著影響，不同光照條件下平均根長均在14.00～15.00 mm，根系較發(fā)達(dá)，須根較多；光照時間對生石花的苗高、莖直徑以及幼苗形態(tài)等有極顯著影響。光照時間越長，其苗高越短，莖直徑越大，整株苗的顏色越深。其中，0 h光照苗高最高，莖直徑最短，植株細(xì)長，頂端葉片顏色為黃色，莖部分呈白色(圖2A)；8 h光照較無光照苗高矮2 mm，且差異極顯著，莖直徑略大但無顯著差異，植株細(xì)長，頂端葉片呈黃綠色，整株苗顏色呈白綠色；16 h光照無論苗高和莖直徑與0、8 h均有極顯著差異，個體矮壯，長勢整齊，整體呈綠色(圖2B)；24 h光照較16 h無論苗高和莖直徑均有極顯著差異，苗高最矮，莖直徑最長，植株矮壯，頂端葉片呈深綠色，莖呈綠色。為了保證其正常發(fā)育，控制光照時間為16 h。

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different lowercases indicated significant differences(P<0.05); different capital letters indicated extremely significant differences(P<0.01).

2.3激素配比及浸泡時間對生石花種子萌發(fā)的影響由表4可知，各因素最優(yōu)水平為0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0.8 mg/mL NAA+0.1或0.2 mg/L 6-BA以及4 h的浸泡時間。方差分析結(jié)果表明，除浸泡時間和GA濃度外，其他因素對種子萌發(fā)率無顯著影響。根據(jù)表4以及因素水平選取的原則即主要因素選最優(yōu)水平，次要因素權(quán)衡利弊綜合考慮，其最優(yōu)條件為0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0 mg/mL NAA+0 mg/mL 6-BA以及4 h的浸泡時間，即26號為最優(yōu)條件，與12號相比無顯著差異，均可有效提高種子萌發(fā)率至94%。

3　結(jié)論與討論

(1)生石花種子萌發(fā)和幼苗生長培養(yǎng)基的選擇。該研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基的種子萌發(fā)率均優(yōu)于對照，且不同培養(yǎng)基間種子萌發(fā)率也存在差異。通過比較培養(yǎng)基中種子的萌發(fā)率、幼苗的根和莖生長情況，確定1/2 MS培養(yǎng)基最適合生石花種子萌發(fā)與幼苗生長，這與前人通常采用1/2MS培養(yǎng)基作為其他植物種子萌發(fā)培養(yǎng)基的結(jié)果一致[17-19]。進(jìn)一步比較MS、3/4MS和1/2MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)生石花種子萌發(fā)及幼苗生長的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基稀釋倍數(shù)越大越適合生石花種子萌發(fā)和幼苗生長。該試驗結(jié)果表明，18 d前生石花的種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢B5培養(yǎng)基均大于MS培養(yǎng)基，其后MS培養(yǎng)基種子萌發(fā)率大于B5培養(yǎng)基，最終MS培養(yǎng)基萌發(fā)率高于B5培養(yǎng)基2%，差別較小。但B5培養(yǎng)基中生石花根長、苗高和苗直徑均優(yōu)于MS培養(yǎng)基，根系的發(fā)達(dá)程度極顯著優(yōu)于MS培養(yǎng)基，利用B5培養(yǎng)基進(jìn)行生石花種子萌發(fā)和幼苗生長總體優(yōu)于MS培養(yǎng)基。如果將B5培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，有可能獲得1/2MS新的種子萌發(fā)和生長培養(yǎng)基。以上推測正在設(shè)計試驗進(jìn)一步驗證。

表4　 正交試驗結(jié)果

(2)生石花種子萌發(fā)和幼苗生長光照時間的選擇。作為原產(chǎn)地為南非熱帶地區(qū)的觀賞植物，生石花接受的光照時間以及強(qiáng)度更長更劇烈，這也造就了其植株矮小、莖部粗壯、葉片深綠等的形態(tài)特點(diǎn)，植株太高或莖部太細(xì)均是缺乏光照的表現(xiàn)。通過對比不同光照時間下的種子萌發(fā)率及幼苗生長情況，發(fā)現(xiàn)無光照會導(dǎo)致生石花幼苗生長過于細(xì)長，葉片發(fā)黃，生石花僅靠根部吸收培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)生存，不利于其生長；24 h光照時間下，由于光合作用一直進(jìn)行，使其葉片生長過快成圓盤狀，莖部過短，幼苗整體太過矮小，同樣不利于其生長；而16 h光照時間下，無論植株形態(tài)或根生長情況都符合正常觀賞要求，且符合自然規(guī)律。最終確定16 h為最優(yōu)光照時間。

(3)激素對生石花種子萌發(fā)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，0.1～0.3 mg/mL GA和IAA 以及0.025 mg/mL 6 -BA對羊草種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用[20]，用1.5 mg/mL的GA、0.05 mg/mL的6-BA 及0.1 mg/mL IAA 浸種可有效提高香椿種子發(fā)芽率[21]，但對于藥用紫蘇而言，高濃度的6-BA 和NAA有明顯抑制作用，GA則有促進(jìn)作用[22]。該試驗結(jié)果表明，浸泡時間和GA濃度是影響生石花種子萌發(fā)最大的因素(差異達(dá)顯著水平)，其次是IAA濃度(有差異但未達(dá)顯著水平)，而NAA濃度及6-BA濃度對種子萌發(fā)率的影響最小。最優(yōu)組合為0 mg/mL IAA+0.1 mg/mL GA+0 mg/mL NAA+0 mg/mL 6-BA及4 h的浸泡時間。GA對種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，與前人研究結(jié)果一致[20-22]。而6-BA、IAA以及NAA對生石花種子萌發(fā)率無顯著影響，與前人的研究結(jié)果不一致[20-21]，可能是由于物種不同，種子萌發(fā)過程對激素的敏感程度不同。

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Screening of Different Mediums and Hormone Concentrations for Seed Germination and Growth Conditions ofLithops

FAN Li-nan1, ZHANG Zong-shen2, LIU Ping-wu1*

(1. School of Aonomy, Guangxi University,State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, Nanning, Guangxi 530004; 2. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, Liaoning 116034)

[Objective] To optimize the seed germination condition ofLithops, and to enhance the germination rate of seeds using MS culture medium to replace soil as growth medium ofLithops. [Method] Compared with the seed germination rate, root growth and seedling growth in different culture mediums, we screened the illumination time, hormone proportion and soaking time. [Result] 1/2 MS culture medium is the most suitable culture medium for the germination and growth ofLithopsseeds. Illumination for 16 h was the optimal time. The factors influencing degree from big to small was soaking time, GA concentration, IAA concentration and 6-BA concentration. Among them, GA concentration and soaking time had significant effects on seed germination. And 0.1 mg/mL GA and 4 h soaking time were the optimal combination. [Conclusion] This research provides basis for the rapid propagation technique ofLithopstissue culture.

Lithops; Culture medium; Seed germination; Hormone; Illumination time

范麗楠(1990- )，女，山東黃縣人，碩士研究生，研究方向：作物種子技術(shù)與良種繁育。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事油菜分子生物學(xué)研究。

2016-05-18

S 603.6

A

0517-6611(2016)18-123-04