蘿藍花粉母細胞減數(shù)分裂觀察及核型分析

龍艷平，沈真實，伍祥興

（1. 湖南隆平種業(yè)有限公司，湖南 長沙 410125；2. 瀏陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖南 瀏陽410300）

蘿藍花粉母細胞減數(shù)分裂觀察及核型分析

龍艷平1，沈真實2，伍祥興2

（1. 湖南隆平種業(yè)有限公司，湖南 長沙 410125；2. 瀏陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖南 瀏陽410300）

采用壓片法，對蘿藍（Raphanobrassica，2n=38，RRAA）的花粉母細胞減數(shù)分裂及體細胞核型進行了研究。結(jié)果表明：蘿藍的絕大多數(shù)花粉母細胞減數(shù)分裂中染色體的行為正常，終變期同源染色體配對后可形成18個二價體；在少數(shù)花粉母細胞減數(shù)分裂中觀察到落后染色體、染色體橋等異常行為；其減數(shù)分裂為同時型，其花粉粒育性為91.8%。蘿藍的染色體數(shù)目為2n=4X=36，核型公式為K（2n）=2X=36=30m +6sm，其核型為“2B”型。

蘿藍；染色體；減數(shù)分裂

蘿卜（Raphanus sativus L.，2n=2x=18）屬十字花科，是一種重要的蔬菜作物，早期人們發(fā)現(xiàn)蘿卜與蕓薹屬的一些植物如白菜（Brassica rapa L.，2n=20，AA）或甘藍（Brassica oleracea L.，2n=18，CC）之間的雜交后代營養(yǎng)體生長優(yōu)勢明顯，具有蔬菜或飼料作物的開發(fā)潛力而被人工合成為異源四倍體，稱為蘿藍，命名為Raphanobrassica（蘿卜作母本）或Brassicoraphanus（蘿卜作父本），成為一個新物種［1-3］。隨著研究的深入，進一步發(fā)現(xiàn)蘿卜是具有多種抗源和優(yōu)異性狀的育種材料，向蕓薹屬植物中導(dǎo)入有價值的基因逐漸成為屬間雜交的主要目標。而蘿卜屬與蕓薹屬之間有性雜交不親和性及雜種敗育現(xiàn)象明顯，一些常規(guī)的技術(shù)和方法如混合授粉、切柱頭、化學(xué)藥物處理等對蕓薹屬與蘿卜的遠緣雜交效果不大。但通過蘿藍作為橋梁，同蕓薹屬植物雜交，導(dǎo)入蘿卜的遺傳物質(zhì)，成功率相對較高，至今已有多種基因被挖掘利用，如 Lelivelt等［4］和Peterka等［5］分別以蘿卜-白菜（Raphanobrassica，2n=38，RRAA）和蘿卜-甘藍（Raphanobrassica，2n=36，RRCC）為親本，與甘藍型油菜反復(fù)回交，不斷選擇偏甘藍型性狀雜交后代，成功地將蘿卜中抗根結(jié)線蟲基因?qū)敫仕{型油菜（命名為蘿藍）。陳衛(wèi)江等［6］以蘿藍為供體材料，將蘿卜恢復(fù)基因?qū)敫仕{型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育（Ogu CMS）恢復(fù)材料CLR650中，轉(zhuǎn)育出甘藍型油菜Ogu CMS的新型恢復(fù)材料，表明人工合成的蘿藍在蘿卜和蕓薹屬間基因的交流過程中有著重要的作用，研究通過對蘿藍的小孢子發(fā)育過程觀察、花粉粒育性鑒定以及對其體細胞染色體進行核型分析，旨在為蘿藍的進一步利用提供細胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試材料為蘿藍（Raphanobrassica，2n=4x=36，RRCC），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟院士1993年提供，每年選取典型單株套袋自交，保存種植于湖南省作物研究所試驗田，在植株現(xiàn)蕾時取材。

1.2方 法

1.2.1體細胞觀察方法有絲分裂觀察時，從植株上取幼小花序，經(jīng)0.002 mol/L 8-羥基喹啉在22℃下處理5 h后于乙醇∶冰醋酸（3∶1）混合液中固定過夜。顯微鏡下觀察時，先剝出雌蕊，用蒸餾水沖洗后，在l mol/L的鹽酸中60℃水浴3～5 min，卡寶品紅染色1 min，壓片并置于油鏡下觀察計數(shù)。

1.2.2減數(shù)分裂觀察方法減數(shù)分裂觀察時，在上午9：00～11：00，下午3：00～5：00取花序頂端幼小花蕾在卡諾固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定24 h，用l mol/L鹽酸60℃恒溫解離5～6 min，從花蕾中取出花藥，在載片上解剖出花粉母細胞，滴1滴改良卡寶品紅，壓片鏡檢?；ǚ塾杂^察時，可取當日開放花朵的花粉粒涂于載玻片上，用醋酸洋紅染色3 min后，顯微鏡下觀察攝影。

1.2.3核型分析方法取50個以上分散良好、著絲點清晰的中期細胞進行染色體數(shù)目統(tǒng)計，并從中選擇5個分散較好的分裂相進行顯微攝影及核型數(shù)據(jù)測量。核型分析方法參照李懋學(xué)等［7］的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1花粉母細胞減數(shù)分裂過程觀察

蘿藍大部分花粉母細胞減數(shù)分裂過程中染色體的行為正常。粗線期可觀察到染色體明顯變粗及染色較深的染色粒（圖1-a）。終變期觀察到18個形態(tài)清晰的二價體（圖1-b），佐證了蘿藍的染色體數(shù)目為2n=36，該時期也是進行染色體計數(shù)的最佳時期。在中期I，二價體聚集并整齊排列到赤道面上形成赤道板（圖1-c），此期一些細胞中出現(xiàn)染色體落后現(xiàn)象（圖1-d）。后期I，同源染色體分離，向細胞的兩端移動（圖1-e），此期少數(shù)細胞中出現(xiàn)染色體橋及染色體落后現(xiàn)象（圖1-f）。末期I細胞質(zhì)不分裂，前期II，染色體分散到細胞質(zhì)中，每個子細胞中具有18個單價體（圖1-g）。中期II，2個子細胞中的染色體均排列到細胞的赤道面（圖1-h），此期少數(shù)細胞中出現(xiàn)染色體落后的情況（圖1-i）。后期II姐妹染色單體分開，分別走向細胞兩極，此時在細胞內(nèi)可明顯觀察到4組染色體（圖1-j）。末期Ⅱ細胞內(nèi)部形成4個子細胞，發(fā)育為四分體（圖1-l），另外，此期有少數(shù)三分體及多分體形成，減數(shù)分裂方式屬于同時型，在減數(shù)分裂過程中約有7.7%的花粉母細胞出現(xiàn)染色體異常分離現(xiàn)象。與麥藍菜［8］、毛車前［9］和半支蓮［10］等植物的花粉母細胞減數(shù)分裂過程相似。

圖1　蘿藍花粉母細胞減數(shù)分裂（a：粗線期；b：終變期；c：中期Ⅰ；d：中期Ⅰ落后染色體；e：后期Ⅰ；f：后期Ⅰ染色體橋；g：末期Ⅰ；h：中期Ⅱ；i：后期Ⅱ；j：末期Ⅱ；k：四分體；l：花粉粒。標尺長度=5μm）

2.2花粉粒育性觀察結(jié)果

隨機選擇幾個視野，共觀察統(tǒng)計了1 272個花粉粒的醋酸洋紅染色反應(yīng)結(jié)果，其中不育花粉粒僅104個，花粉育性為91.8%，敗育率為8.2%。

2.3染色體數(shù)目觀察結(jié)果

通過對蘿藍根尖細胞63個視野良好中期分裂相的染色體數(shù)目統(tǒng)計，確定其染色體數(shù)目為2n=36，同時花粉母細胞減數(shù)分裂終變期可觀察到18個二價體，未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目變異。核型分析參數(shù)取自5個中期細胞染色體的平均值，核型分析內(nèi)容見表1，核型圖見圖3。蘿藍最長染色體和最短染色體之比為3.8，核型不對稱系數(shù)為61.19%，核型公式為K（2n）=4X=36=30m+6sm，核型類型為“2B”型。

圖2　蘿藍花粉粒醋酸洋紅染色反應(yīng)

圖3　染色體中期分裂相及核型

3 結(jié)論與討論

蘿藍是人工合成的為數(shù)不多的雙二倍體雜種，在自然界的被子植物中，多倍體現(xiàn)象最為常見，而人工合成的多倍體往往存活困難，且經(jīng)濟性狀較差［11］，多倍體植物在進化上取得的成功與人類在新合成多倍體領(lǐng)域的表現(xiàn)相差甚遠，通過對人工多倍體的研究，將有助于進一步了解植物進化、物種形成以及雜種優(yōu)勢的機制。蘿藍經(jīng)人工合成后，也出現(xiàn)過自交結(jié)實差及雜種敗育現(xiàn)象，經(jīng)過多代自交后，株系間植株形態(tài)已經(jīng)沒有太大差別，研究結(jié)果表明，蘿藍的染色體數(shù)目為2n=4x=36，減數(shù)分裂時，絕大多數(shù)終變期能形成18對二價體，后期染色體都能均等分配到細胞兩極，蘿藍植株中蘿卜和甘藍的染色體已基本能夠正常配對和分離，類似于正常二倍體物種的減數(shù)分裂行為，表明其在細胞學(xué)水平已經(jīng)穩(wěn)定。

蘿藍在進行減數(shù)分裂時僅在少數(shù)花粉母細胞中觀察到染色體落異?，F(xiàn)象，花粉粒育性為91.8%。程志號等［12］在黃芩、馬玉濤等［13］在益母草及杜玉娟等［14］在半枝蓮的研究中，均認為小孢子發(fā)育過程中染色體行為異常，如染色體落后、不均等分裂及多分體現(xiàn)象等會導(dǎo)致了子細胞中遺傳物質(zhì)的不均衡分配，最終導(dǎo)致一部分花粉出現(xiàn)敗育。在進化上植物通過花粉敗育淘汰染色體數(shù)目變異的配子，也是維持物種的穩(wěn)定性的一種途徑［15］。因此，蘿藍中部分花粉母細胞在減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)染色體落后、染色體橋等異?，F(xiàn)象可能是導(dǎo)致8.2%花粉敗育的主要原因。

表1　蘿藍染色體相對長度、臂比及類型

蘿藍的染色體組來自蘿卜和甘藍，沙玉輝等對3種不同皮色蘿卜種質(zhì)染色體形態(tài)及核型組成具分析之后，認為3種蘿卜種質(zhì)平均臂比為1.28～1.50，不存在臂比大于2的染色體，核型類別都為1A型，推測這3個蘿卜種質(zhì)處于系統(tǒng)發(fā)生的較初始階段［16-17］。張蜀寧等［18-19］對甘藍類作物7個變種核型分析結(jié)果表明，核型分類均屬于2A型，為基本對稱型核。研究中蘿藍的染色體組一半來自蘿卜，另一半來自甘藍，經(jīng)過多年的自交，植株形態(tài)穩(wěn)定，染色體減數(shù)分裂也已正常，核型分析結(jié)果顯示蘿藍的核型公式為K（2 n）=4 X=36=30 m+6 sm，表明蘿藍的染色體組中包括15對中著絲粒染色體和3對近中著絲粒染色體，核型類型為“2B”型。由于甘藍和蘿卜的染色體屬于小染色體類型［20］，染色體形態(tài)又非常相似，直接壓片后在顯微鏡下難以分辨出其染色體組成，可以借助于染色體分帶、原位雜交以及分子標記等方面的技術(shù)，為進一步探討蘿藍的進化、種內(nèi)親緣關(guān)系及育種工作提供更準確的信息。

［1］ Tokumasu S. The increase of seed fertility of Brassicoraphanus through cytological irregularity ［J］. Euphytica，1976，（25）：463-470.

［2］ 胡大有，王愛云. 甘藍型油菜與蘿卜屬間雜種的獲得及分子鑒定［J］.中國油料作物學(xué)報，2006，28（4）：476-479.

［3］ 殷家明，唐章林，李加納，等. Ogura不育胞質(zhì)對甘藍型油菜與蘿卜種間可交配性的影響［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2002，18（1）：33-35.

［4］ Lelivelt C L C，Lange W，Dolstra O. Intergeneric crosses for the transfer of resistance to the beet cyst nematode from Raphanus sativus to Brassica napus ［J］. Euphytica，1993，（68）：111-120.

［5］ Peterka H，Budahn H，Schrader O. Transfer of resistance against the beet cyst nematode from radish（Raphanus sativus） to rape （Brassica napus） by monosomic chromosome addition ［J］. Theor Appl Genet，2004，109（1）：30-41.

［6］ 陳衛(wèi)江，李 莓，王同華，等. 甘藍型油菜蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)材料的創(chuàng)制［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，（14）：18-25.

［7］ 李懋學(xué)，陳瑞陽. 關(guān)于植物核型分析的標準化問題［J］. 武漢植物學(xué)研究，1985，3（4）：297-302.

［8］ 王俊杰，馬玉濤，惠榮奎，等. 麥藍菜的花粉母細胞減數(shù)分裂及核型分析［J］. 中國野生植物資源，2011，（4）：53-56.

［9］ 張書芹，王俊杰，史大聰，等. 毛車前的花粉母細胞減數(shù)分裂及核型分析［J］. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，（6）：124-127.

［10］ 杜玉娟，程志號，王 沫，等. 半枝蓮花粉母細胞減數(shù)分裂觀察及核型分析［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，（1）：93-96.

［11］ 徐傳遠，王麗萍. 多倍體植物的遺傳和表觀遺傳現(xiàn)象［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（49）：2575-2578.

［12］ 程志號，蔡明歷，郝大翠，等. 黃芩的花粉母細胞減數(shù)分裂及核型分析［J］. 中國野生植物資源，2010，（29）：34-37.

［13］ 馬玉濤，惠榮奎，崔 穎，等. 益母草基于45S rDNA染色體定位的核型分析及減數(shù)分裂觀察［J］. 園藝學(xué)報，2011，38（1）：125-132.

［14］ 杜玉娟，程志號，王 沫，等. 半枝蓮的花粉母細胞減數(shù)分裂觀察及核型分析［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2009，（1）：93-96.

［15］ 李潤芳，呂 松，鄧瑞寧，等. 薺菜的花粉母細胞減數(shù)分裂及核型分析［J］. 中國油料作物學(xué)報，2008，30（4）：506-510.

［16］ 沙玉輝，劉 莉，王 康，等. 3種不同皮色蘿卜種質(zhì)染色體核型分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2009，（28）：1141-1145.

［17］ 李懋學(xué). 植物染色體大小和變異［J］. 植物學(xué)通報，1985，（5）：14-16.

［18］ 張蜀寧，張紅梅，鄭金雙，等. 甘藍類作物的核型分析與比較［J］.中國蔬菜，2011，（2）：30-35.

［19］ 劉 英，王 超. 簡述甘藍類植物的起源及分類［J］. 北方園藝，2006，（4）：58-60.

［20］ 楊 萍，利容千，曾子紳. 甘藍和芥藍的核型與孢粉學(xué)研究［J］. 植物分類學(xué)，1988，26（5）：362-366.

（責任編輯：肖彥資）

Karyotype Analysis and Meiotic Observations of Pollen Mother Cells of Raphanobrassica

HUI Rong-kui1，SHEN Zhen-shi2，WU Xiang-xing2
（1. Hunan Longping Seed Co. Ltd.， Changsha 410125， PRC； 2. Liuyang Agricultural Technology Extension Center， Liuyang 410300， PRC）

By using the squash method， the meiosis of pollen mother cells and somatic karyotype of Raphanobrassica were studied. The results showed that the chromosome in normal behavior during the most Raphanobrassica pollen mother cells meiosis， homologous chromosomes after pairing can form 18 bivalents in diakinesis； lagging chromosomes， chromosome bridge and other abnormal behaviors were observed in a small number of pollen mother cells meiosis； its meiosis was simultaneous type， and its pollen fertility was 91.8%. The chromosome number of Raphanobrassica is 2n=4X=36， the karyotype formula is K（2n）=2X=36=30m+6sm， the karyotype is “2B”.

Raphanobrassica； chromosome； meiosis

Q253

A

1006-060X（2016）08-0006-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.08.002

2016-06-29

龍艷平（1968-），女，湖南長沙市人，助理農(nóng)藝師，研究方向為油菜遺傳育種。