改良線栓法制備SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型研究*

劉　波，李　菲，王麗娜，劉佳云（遵義醫(yī)學院：.藥理學教研室/基礎藥理教育部重點實驗室；2.病理生理學教研室，貴州遵義563003）

·論著·

改良線栓法制備SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型研究*

劉波1，李菲1，王麗娜1，劉佳云2△（遵義醫(yī)學院：1.藥理學教研室/基礎藥理教育部重點實驗室；2.病理生理學教研室，貴州遵義563003）

目的在局灶性腦缺血再灌注模型制備中對線栓法進行改良，以促進線栓順利進出，提高2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色質量。方法取SPF級雄性SD大鼠60只，隨機分為A組（常規(guī)栓線組）、B組（栓線加長組）和C組（栓線加長和改良TTC染色組），每組20只，制備局灶性腦缺血再灌注模型。術后比較分析三組大鼠的死亡率、栓線回縮數量、神經功能評分、拔栓線時所需時間、腦組織病理學切片及TTC染色結果。結果B、C組大鼠栓線回縮至切口發(fā)生率（均為0）低于A組［40.0%（8/20）］，再灌注耗時［（1.09±1.90）、（1.13±0.31）min］較A組［（5.57±1.90）min］明顯縮短，差異均有統計學意義（P＜0.05）。術后12 h，B、C組神經功能缺損評分［（2.32±0.63）、（2.35±0.46）分］與A組［（2.42±0.50）分］比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。蘇木精-伊紅染色結果顯示，B、C組病理組織學改變與A組相似。TTC染色結果顯示，A、B兩組染色后顏色分明，對比明顯，C組即便用錫箔紙進行避光處理，避光染色效果仍不理想。結論延長栓線長度能簡化再灌注退栓線時的操作，采用棕色安瓿瓶進行TTC染色能提高染色質量。

大鼠，Sprague-Dawley；腦/病理學；頸總動脈；腦缺血；再灌注

缺血性腦血管疾病是一類高發(fā)病率、高致死率、高致殘率疾病，給社會及患者家庭帶來沉重的負擔。缺血后再灌注可進一步加重缺血性損傷，建立有效的腦缺血再灌注模型，對開展腦缺血再灌注損傷的研究具有重要意義。目前常采用線栓法局灶性腦缺血再灌注模型［1-4］。其具有不開顱、易把握栓塞位置，可準確控制缺血和再灌注時間、大腦中動脈閉塞效果較理想等優(yōu)點，因此應用較為廣泛［5］。SD大鼠為制備腦缺血再灌注模型的常用實驗動物，因其腦血管解剖結構和功能與人類相近，具有價廉易得、抗感染能力強等特點而廣泛應用于腦血管疾病的基礎研究［6］。而現階段的改良模型仍存在一些問題，如再灌注時栓線容易回縮至切口內，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl fourazolenitrogen chloride staining，TTC，又稱紅四氮唑）染色顏色不明顯等。本研究結合改良模型制作的基本方法，在栓線長度和TTC染色步驟技巧等方面加以適當改進，以期簡化手術過程，縮短操作時間，提高模型成功率。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠60只，體質量250～300 g。將其隨機分為A、B、C三組，每組20只。A組：常規(guī)栓線組；B組：栓線加長組；C組：栓線加長和改良TTC染色組。SD大鼠由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物中心提供［SCXK（渝）2007-0005］。

1.1.2試劑及栓線準備栓線由北京沙東生物技術有限公司提供（不同體質量的SD大鼠選擇不同型號的栓線，根據需要選擇栓線的級別），線身直徑0.26mm，頭端包被多聚賴氨酸，線頭直徑（0.36±0.02）mm，球端相距19～20mm處有黑色標記，線長40、60mm。TTC（分析純）由上海山浦化工有限公司提供。此外，準備60W白熾燈、磷酸鹽緩沖液（PBS）、聚維酮碘、青霉素等。

1.2方法

1.2.1術前準備實驗前對SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，自由飲水、進食。術前12 h禁食，自由飲水，用苦味酸做好標記。實驗器械高壓蒸汽法滅菌，烘干。7%水合氯醛0.5mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，頸前區(qū)備皮，聚維酮碘消毒。術中用白熾燈保溫。

1.2.2線栓法制備模型參照Zea Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，然后再鈍性分離胸骨舌骨肌和胸骨乳突肌后可見動脈鞘，分離和結扎頸總動脈（CCA），在分離CCA時動作要輕柔，以減少對迷走神經的刺激。并在CCA近心端、遠心端分別穿線，近心端系緊，遠心端系一松結備用。沿著CCA，到達甲狀腺的位置便分為頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），在肉眼直視下可見到CCA的“Y”型分叉狀結構。用尖頭彎鑷緊貼著“Y”形分叉處分離ECA、ICA，并在ECA穿線結扎，用微動脈夾夾閉ICA。然后用鑷子柄或手指墊于CCA下，剪一“V”字型切口，插入栓線，用備用的絲線打一正結，松開ICA的動脈夾，然后調整線栓角度，使線栓弧度水平向外，輕輕將線栓送入顱內，注意手的感覺，輕緩推進，直至感覺到阻力或栓線標記接近CCA與ICA分叉處為止。把CCA上的絲線打一反結固定，記錄栓線進入的時間，確定無活動性出血后縫合肌肉與皮膚層，縫合皮膚的過程中不能碰到栓線，且栓線的殘端要留在皮膚外，肌內注射青霉素預防感染。于2 h后向外拔出栓線進行再灌注，把栓線退出至標記點露出皮膚為止，檢查皮膚外的栓線，為防止出血，栓線殘留應留在血管內。手術過程中注意保持大鼠體溫。A組用常規(guī)栓線（栓線長度為40mm），B、C組均用加長的栓線（栓線長度為60mm）。

1.2.3神經功能缺損評分術后12 h，根據Bederson等［7］建立的5分評分法進行神經功能缺陷評分。無神經癥狀為0分；大鼠不能伸展缺血側前肢，具體表現為患側前肢不能肩內旋、肘外展、緊貼胸壁為1分；將大鼠置于地面時，推動患側肩向對側移動時，阻力明顯降低為2分；大鼠自由行走，會在地面轉圈，或行走時身體傾斜為3分；軟癱，肢體無自發(fā)性活動為4分。待大鼠清醒后進行神經功能缺陷評分，評分為1～3分，表明造模建立成功，剔除0分無癥狀及4分癥狀過重的模型大鼠。

1.2.4組織病理學觀察取出大腦標本石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化，二甲苯原液脫蠟2次，每次15min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1次，每次5min，自來水沖洗10min。蘇木精染色約5min，自來水沖洗10min；鹽酸乙醇分化約20 s，自來水沖洗返藍10min；伊紅染色約2min，自來水沖洗10min；逆乙醇梯度脫水，二甲苯再次透明，最后進行封片，Leica光學顯微鏡下觀察病理學變化，并拍照記錄。

1.2.5TTC染色缺血再灌注24 h后進行TTC染色。0.4%TTC母液和PBS以1∶3的比例混勻。TTC染色中需要注意避光，TTC混合液使用棕色的安瓿瓶分裝（每瓶約5mL）。大鼠麻醉后剪下頭部，取出腦組織，于-20℃冰凍5min左右后置于腦模具中，平均切成5片，將腦片放入棕色的安瓿瓶，將安瓿瓶橫放于37℃溫箱中染色30min。為防止腦片變形，使染色均勻，每隔5min進行輕微震蕩。染色完畢，倒掉染色液，每瓶加入約5mL 的4%多聚甲醛于安瓿瓶內固定8 h后攝片。A、B組用棕色安瓿瓶，C組用錫箔紙包裹的透明安瓿瓶。

1.3統計學處理應用SPSS12.0統計軟件進行數據分析，計量資料以表示，采用兩獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1栓線長度對大鼠死亡情況、栓線回縮至切口及拔栓線耗時的影響三組大鼠死亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示栓線長度對大鼠死亡數量無明顯影響。B、C組加長栓線長度后，栓線末端均留在切口外，無栓線回縮入切口，無需在再灌注時剪開切口縫線尋找栓線再進行縫合，B、C組大鼠栓線回縮至切口發(fā)生率低于A組，拔栓線耗時明顯短于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1　栓線長度對大鼠死亡情況、栓線回縮至切口及拔栓線耗時的影響

2.2各組存活大鼠神經功能缺損評分比較術后12 h，對各組存活大鼠進行神經功能評分，B、C組神經功能缺損評分［（2.32±0.63）、（2.35±0.46）分］與A組［（2.42±0.50）分］比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.3各組大鼠海馬CA1區(qū)病理組織學觀察蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠海馬神經元形態(tài)，結果顯示，CA1區(qū)大部分神經細胞變性、壞死，結構不清晰，細胞質呈空泡狀、細胞核出現不同程度的固縮，甚至溶解。加長栓線的B、C組病理組織學改變與A組相似。見圖1。

圖1　各組大鼠海馬CA1區(qū)病理組織學觀察（HE，400×）

2.4TTC染色A、B兩組均用棕色安瓿瓶染色，染色后顏色分明，對比明顯（圖2A、B）。C組用透明安瓿瓶染色，即便用錫箔紙進行避光處理，避光染色效果仍不理想（圖2C）。

圖2　三組TTC染色效果比較

3　討　論

線栓法已成為廣大研究者制備腦缺血灶灌注模型最為青睞的方法之一［8-12］。為使模型成功率更高、更穩(wěn)定，研究者對線栓法進行了諸多改進。作者在傳統線栓法的基礎上查閱相關文獻，經反復實踐并總結，對線栓法及TTC染色進行了進一步改良。

3.1大鼠的選擇SD大鼠造模操作簡單，出血量少［13］。選擇雄性大鼠，排除雌激素對大腦的保護作用。為提高造模成功率，大鼠體質量控制在250～300 g［14］。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，為術后大鼠提供適宜的溫度及濕度。

3.2栓線的選擇購買成品栓線，保持規(guī)格一致，根據大鼠體質量范圍選擇不同型號的栓線；其次，選擇栓線的級別以提高模型穩(wěn)定型。

3.3切口及分離的部位切口及分離的部位沿胸鎖乳突肌內側分離肌肉筋膜，暴露CCA，在分離CCA時要動作輕柔，減少對迷走神經的刺激，沿著CCA向上分離ICA、ECA，CCA的“Y”型分叉狀結構。在分離CCA分叉處時用尖頭彎鑷緊貼“Y”型分叉處分離，這樣可以避開對CCA的“Y”型分叉神經和血管的刺激，降低大鼠的死亡率，確保模型的穩(wěn)定性。

3.4插栓線插栓線要使栓線有一定程度的彎曲，保證栓線向屋頂方向彎曲進入ICA，當感到有阻力，且栓線黑色標記到達CCA分叉處時，說明栓線頭端已經到達大腦中動脈起始處。最好用手來插栓線，感知栓線達到大腦中動脈時的阻力，避免栓線插入過深戳破血管引起腦出血。

3.5拔栓線2 h后進行再灌注，以栓線黑色標記退出皮膚為宜，剪短栓線殘端。不能把栓線完全退出，因為易引起出血。實驗結果表明，加長栓線長度，對大鼠病理學損傷和神經功能無明顯影響，但能簡化再灌注步驟。可以避免栓線退回切口后重新打開切口、縫合等步驟，且造模2 h后，大部分大鼠已經蘇醒，再次打開切口會增加大鼠造模時的痛苦。

3.6術后大鼠的護理肌內注射抗生素避免術后感染，保持實驗室溫度在25℃左右，并進行分籠飼養(yǎng)。

3.7TTC染色采用棕色安瓿瓶可以達到良好的避光效果。安瓿瓶橫放，可避免腦片變形，使腦片染色均勻。

總之，線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注的模型技術日益成熟，如何簡化手術操作，降低動物的死亡率，提高模型的穩(wěn)定性，仍需要科研者不斷探索總結。本研究結果表明，延長栓線長度能簡化再灌注退栓線時的操作。采用棕色安瓿瓶進行TTC染色能提高染色質量，值得推廣借鑒。

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讀者·作者·編者

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本刊編輯部

Study onmodified suture-occludedmethod for preparing focal cerebral ischem ic reperfusionmodel in SD rat*

Liu Bo1，LiFei1，Wang Lina1，Liu Jiayun2△（1.Teachingand Researching Section ofPharmacology/Key LaboratoryofBasic Pharmacology ofMinistryofEducation；2.Teachingand Researching Section ofPathophysiology，ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou 563003，China）

Objective To improve the suture-occludedmethod in preparing the focal cerebral ischemia reperfusionmodel for promoting the smooth entry and exitof thread embolism and increasing 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）staining quality.Methods60 SPF grademale SD ratswere selected and randomly divided into the group A（routine suture-occluded group），B（lengthened embolic thread group）and C（lengthened embolic thread plus improved TTC staining group），20 cases in each group.The focal cerebral ischemia reperfusionmodelwas prepared.The postoperativemortality rate，number of thread embolism retraction，neural function score，needing time for pulling out thread embolism，brain tissue pathological section and TTC staining resultswere compared among 3 groups.ResultsThe occurrence rate of thread embolism retraction to incision in ythe group B and Cwas0，whichwas lower than 40.0%（8/20）in the group A；the elapsed time for reperfusion in the group B and C was（1.09±1.90）and（1.13±0.31）min respectively，whichwassignificantly shortened comparedwith（5.57±1.90）min in thegroup A，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）.The neurological impairmentscoresatpostoperative 12 h in the group B and Cwere（2.32±0.63）points and（2.35±0.46）points respectively，which showed no statistical difference compared with（2.42±0.50）points in the group A（P＞0.05）.The HE staining results showed that the histopathologicalchange in the group B and Cwas similar to that in the group A.After TTC staining，the color in the group A and Bwas clearwith obvious contrast，but the effect for avoiding lightand staining in the group Cwas still undesirable，even though conducting the avoid light processing by using the silver paper.ConclusionExtending theembolic thread lengthmay simplify theoperating forwithdrawing the embolic thread in reperfusion and adopting the brown ampoules for conducting staining can improve the staining quality.

Rats，Sprague-Dawley； Brain/pathology； Carotid artery，common； Brain ischemia； Reperfusion

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.02.001

A

1009-5519（2016）02-0161-03

貴州省科學技術基金資助項目（黔科合JZ字［2014］2015號）。

劉波（1986-），碩士研究生，講師，主要從事神經藥理學方面的研究。

，E-mail：363842539@qq.com。

2015-06-30

2015-08-20）