紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表達(dá)分析

張　偉,姬明麗,郭前進(jìn),千智斌

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)　453003)

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紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因克隆及表達(dá)分析

張偉,姬明麗,郭前進(jìn),千智斌

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)453003)

為了研究紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2基因的功能及在脂肪代謝中的分子機(jī)制,從紅鰭東方鲀脂肪組織提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板,利用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增獲得SREBP-1和SREBP-2開放閱讀框(ORF),SREBP-1基因ORF區(qū)的cDNA序列長(zhǎng)度為3 330 bp,編碼1 109個(gè)氨基酸,SREBP-2基因ORF區(qū)的cDNA序列為3 444 bp,編碼1 147個(gè)氨基酸。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SREBP-1基因在紅鰭東方鲀不同組織中的表達(dá)特征,結(jié)果表明,SREBP-1在腦組織中表達(dá)豐度最高,其次為眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟及肝臟,在肌肉中表達(dá)豐度最低。將SREBP-1連接到原核表達(dá)載體pET32a上,利用IPTG對(duì)重組質(zhì)粒pET32a-SREBP-1在大腸桿菌Rosetta(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示在141 kDa處有特異性的條帶出現(xiàn)。

紅鰭東方鲀;SREBP-1基因;SREBP-2 基因;原核表達(dá)

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)是一類含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(bHLH-zip),參與調(diào)控脂肪酸、膽固醇和甘油三酯合成與吸收的重要轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持起著重要的作用[1]。SREBPs家族包含SREBP-1和SREBP-2這2個(gè)基因,分別位于17,22號(hào)染色體上[2]。SREBP-1基因因各自不同啟動(dòng)子的選擇性剪切形成2個(gè)剪切體,分別為SREBP-1a和SREBP-1c,兩者的氨基酸序列長(zhǎng)度不同,SREBP-1c的序列較長(zhǎng)。SREBP-2 基因定位于22號(hào)染色體,其結(jié)構(gòu)上有一段較長(zhǎng)酸性激活域[3],并與SREBP-1a酸性激活域的結(jié)構(gòu)較為相似。Hua等[4]研究發(fā)現(xiàn),SREBP-1和SREBP-2蛋白的結(jié)構(gòu)較為相近,有40%～50%的同源性,物種間也有差異。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂肪代謝的重要核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,其主要在肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞中表達(dá),同時(shí)在脂肪細(xì)胞分化中有著至關(guān)重要的作用[5]。SREBP-1在動(dòng)物的各種組織中都有表達(dá),如小鼠和人的肌肉中[6],以及禽類的腸道及脂肪組織等[7]。SREBP-1作為轉(zhuǎn)錄因子家族SREBPs的成員之一,研究證實(shí)其通過調(diào)控FoxO1、PPARγ等脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá),從而調(diào)節(jié)脂肪代謝的機(jī)制。

目前,對(duì)于魚類SREBP的研究開展的工作較少,筆者所在課題組之前對(duì)紅鰭東方鲀SREBP-1進(jìn)行了電子克隆及生物信息學(xué)分析[8]。本研究克隆了紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因完整的ORF序列,檢測(cè)SREBP-1基因在不同組織的表達(dá),并進(jìn)行原核表達(dá),為深入研究SREBP基因調(diào)控脂肪代謝的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試動(dòng)物為紅鰭東方鲀,取材時(shí)將其放在冰上麻醉,取出腦、眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟、肝臟、肌肉組織9個(gè)組織,用滅菌的DEPC處理水沖洗后,在液氮速凍1 h后取出,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2SREBPs基因的電子克隆

SREBP-1基因的電子克隆已完成[8]。以大黃魚SREBP-2的氨基酸序列(KKF13222.1)為探針在河豚的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://genome.jgi-psf.org/Takru4/Takru4.home.html)中進(jìn)行Blast分析,搜索到與已知的SREBP-2 存在相似性的片段作為紅鰭東方鲀SREBP-2 的預(yù)測(cè)基因。

1.3SREBP-1和SREBP-2 ORF的克隆

利用TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國(guó))從肝臟組織抽提總RNA,以總RNA為模板,利用SuperScript Ⅲ reverse transcriptase(Invitrogen公司,美國(guó))合成cDNA第1條鏈。根據(jù)電子克隆獲得的SREBP-1、SREBP-2基因序列,在ORF區(qū)兩端設(shè)計(jì)引物見表1,RT-PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,總計(jì)35個(gè)循環(huán),最后72 ℃充分延伸10 min。將PCR產(chǎn)物連接于pGEM T-easy載體(Promega公司,美國(guó)),連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,陽性克隆抽提質(zhì)粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在線分析。利用DNAStar軟件中的Editseq程序?qū)塑账岷桶被嵝蛄羞M(jìn)行理化性質(zhì)分析。程序進(jìn)行同源性分析。利用Mega 5.05軟件建立不同物種SREBP氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SREBP-1基因在不同組織的表達(dá)

以9種組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板,利用SYBR Green染料法相對(duì)定量SREBP-1基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)水平。根據(jù)SREBP-1 ORF區(qū)范圍內(nèi)設(shè)計(jì)引物qSREBP1-F和qSREBP1-R(表1)用于RT-qPCR,以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行表達(dá)差異研究。Real-time PCR程序如下：95 ℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性;95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 20 s,進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在IQ 5 Real-time System 熒光定量PCR儀上進(jìn)行,每個(gè)cDNA樣品重復(fù)3次,利用2-ΔΔCt相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1　引物序列

1.6原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

利用帶有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)的引物SREBP-1-EcoRⅠ和SREBP-1-SalⅠ(表1)擴(kuò)增紅鰭東方鲀SREBP-1基因ORF序列,與pGEM-T Easy載體連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。pGEM-T-SREBP-1和pET32a質(zhì)粒采用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切3 h,瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的條帶和載體,用T4DNA連接酶過夜連接后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌。將菌落PCR和雙酶切鑒定陽性的克隆,進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.7目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)

對(duì)pET32a-SREBP-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)大腸桿菌中,在平板上隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基,37 ℃過夜振蕩培養(yǎng),按1∶50的比例轉(zhuǎn)接到20 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時(shí),加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,37 ℃誘導(dǎo)5 h后離心進(jìn)行菌體的收集,利用超聲波破碎,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,收集上清。把PBS緩沖液加到沉淀組分中懸浮。將上清和沉淀測(cè)定濃度,SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

2　結(jié)果與分析

2.1SREBP基因的序列測(cè)定和分析

根據(jù)電子克隆得到的序列設(shè)計(jì)引物,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后,電泳檢測(cè)到3 330,3 444 bp的目的條帶(圖1),符合預(yù)期紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因的ORF區(qū)的大小。測(cè)序結(jié)果表明SREBP-1、SREBP-2 基因序列的全長(zhǎng)分別為3 330,3 444 bp。根據(jù)克隆得到的紅鰭東方鲀SREBP-1、SREBP-2 基因ORF區(qū)的序列利用DNASTAR軟件推測(cè)其氨基酸序

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.SREBP-1;2.SREBP-2。

圖2　紅鰭東方鲀SREBP-2 基因cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

列,發(fā)現(xiàn)SREBP-1編碼氨基酸為1 109個(gè),與電子克隆結(jié)果一致[8],SREBP-2 編碼1 147個(gè)氨基酸(圖2),理論等電點(diǎn)為8.22,分子質(zhì)量為125.53 kDa。對(duì)紅鰭東方鲀SREBP-1和SREBP-2蛋白進(jìn)行功能域的分析,其氨基端均有1個(gè)SREBPs家族的保守的結(jié)構(gòu)域——堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bHLH-zip)。

將紅鰭東方鲀SREBP-2蛋白的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)與大黃魚的同源性最高為82%,與尼羅羅非魚、青鳉的同源性較高,分別為80%,76%。利用Mega 5.05以鄰位相接(N-J)構(gòu)建不同物種SREBP蛋白的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)發(fā)現(xiàn)：分子進(jìn)化樹分為SREBP-1、SREBP-2兩大支。SREBP-1又分為2個(gè)小支,紅鰭東方鲀SREBP-1與其他魚類聚為1支,另1支為哺乳動(dòng)物類。紅鰭東方鲀SREBP-1與黃斑藍(lán)子魚的親緣關(guān)系最近,與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。SREBP-2也分為2小支,1支為紅鰭東方鲀SREBP-2與其他魚類,另外1支為哺乳動(dòng)物聚為另外1支。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),紅鰭東方鲀SREBP-2與大黃魚的親緣關(guān)系最近,與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3　紅鰭東方鲀SREBP與其他生物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2SREBP-1基因在不同組織的表達(dá)分析

利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)SREBP-1在紅鰭東方鲀的9種組織轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)SREBP-1基因在腦中的表達(dá)量最高,其次是眼、脂肪組織、腸、鰓、脾臟、心臟及肝臟,在肌肉組織中的表達(dá)量最低(圖4)。

2.3pET32a-SREBP-1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

用EcoRⅠ和SalⅠ對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-SREBP-1進(jìn)行雙酶切鑒定(圖5),1條為載體,1條為目的條帶。測(cè)序結(jié)果表明,所測(cè)序列沒有堿基缺失及變異,故初步確認(rèn)所構(gòu)建的pET32a-SREBP-1重組表達(dá)質(zhì)粒是成功的,可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4融合蛋白的表達(dá)與純化

將重組質(zhì)粒pET-32a-SREBP-1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)并利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)5 h后,收集細(xì)菌并進(jìn)行超聲波破碎,利用SDS-PAGE電泳進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)后pET-32a-SREBP-1,出現(xiàn)約141 kDa的蛋白條帶(圖6),與推測(cè)的相符。在上清中含有目的蛋白較多,故融合蛋白是可溶性的。

圖4　SREBP-1基因的組織表達(dá)特性

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a-SREBP-1質(zhì)粒雙酶切。

M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化;2.沉淀;3.上清;4.總菌液;5.空白質(zhì)粒。

M.Protein Marker;1.Purified recombinant SREBP-1 protein;2.Sedimentation;3.Supernatant;4.EscherichiacoliRosetta (DE3) contained pET32a are induced by IPTG;5.pET32a.

圖6重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

Fig.6SDS-PAGE analysis of expression of the SREBP-1 in Rosetta (DE3)

3　結(jié)論與討論

SREBPs有3種亞型：SREBP-1a調(diào)節(jié)所有SREBP的下游靶基因,主要調(diào)控脂肪酸,其次是膽固醇的合成;SREBP-1c主要是調(diào)節(jié)磷脂和甘油三酯的合成;SREBP-2主要調(diào)控膽固醇的合成[9-10]。哺乳動(dòng)物的SREBP蛋白具有一個(gè)進(jìn)化比較保守的功能域—bHLH-zip區(qū)域,是發(fā)生二聚化與DNA結(jié)合的區(qū)域[11]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)紅鰭東方鲀的SREBP-1和SREBP-2蛋白的氨基端都存在bHLH-zip區(qū),因此，推測(cè)可能具有調(diào)控脂肪代謝的功能。因?yàn)镾REBP-1基因在物種上的差異及可選擇的編碼序列的不同有SREBP-1a、SREBP-1c等不同的變體的存在[12-14]。然而，在魚類中只有SREBP-1基因[15]，該基因在魚類調(diào)控脂肪代謝的分子機(jī)制是魚類營(yíng)養(yǎng)學(xué)中重要的研究課題[9,16-18]。但魚類的SREBP-1基因否具有哺乳動(dòng)物的SREBP-1a和SREBP-1c的功能還有待研究。

紅鰭東方鲀組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)SREBP-1在所有檢測(cè)的組織中均有表達(dá),在大腦組織中表達(dá)的最高。藍(lán)子魚SREBP-1基因在腦、眼和腸道中的表達(dá)量相對(duì)比較高[19]。大西洋鮭魚SREBP-1基因在腸道的表達(dá)水平最高,其次是大腦和鰓[15]。哺乳動(dòng)物SREBP-1a和SREBP-1c在組織中表達(dá)也有差異,SREBP-1c在脂肪組織中表達(dá)量最高,SREBP-1a是在肝臟中表達(dá)量最高[12]。研究表明,雞SREBP-1基因主要在腹部脂肪和心臟中的表達(dá)量較高,而在肝臟、胃、脾臟、腎臟等組織中表達(dá)量較低[20]。由此可見,紅鰭東方鲀SREBP-1基因的組織分布和魚類的較為接近,尤其是黃斑藍(lán)子魚,與哺乳類動(dòng)物有比較大的差異,可能因?yàn)轸~類合成脂肪酸的主要部位在大腦,而哺乳動(dòng)物脂肪酸合成主要在肝臟和脂肪組織。

為了進(jìn)一步研究SREBP-1蛋白的功能,將紅鰭東方鲀SREBP-1基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a,成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-SREBP-1,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)在大腸桿菌中的表達(dá)。收集菌液進(jìn)行超聲波破碎,鑒定在上清和沉淀中是否有目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上清中的表達(dá)量較多,利用SDS-PAGE電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)表達(dá)后的融合蛋白的分子質(zhì)量大約為141 kDa。pET-32a-SREBP-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及SREBP-1融合蛋向的成功表達(dá)為抗體的制備及深入研究SREBP-1蛋白的功能提供了基礎(chǔ)的材料。

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Cloning and Expression of SREBP-1 and SREBP-2 in Torafugu Takifugu rubripes

ZHANG Wei,JI Mingli,GUO Qianjin,QIAN Zhibin

(School of Basic Medical Science,Xinxiang Medical University,Xinxiang453003,China)

In order to study the function and molecular mechanism ofSREBP-1 andSREBP-2, the open reading frames (ORF) of torafuguSREBP-1 andSREBP-2 genes were amplified from total RNA of adipose tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The results showed that the ORF ofSREBP-1 was composed of 3 330 bp,encoding 1 109 amino acids,while the ORF ofSREBP-2 was composed of 3 444 bp,encoding 1 147 amino acids.The expression ofSREBP-1 gene in torafugu tissues was determined using Real-time quantitative PCR,presenting that the highest expression was in brain,followed in eye,adipose tissue,spleen,gill,intestine,heart and liver,but the lowest in muscle.The prokaryotic expression system of recombined vector pET32a-SREBP-1 was constructed successfully.SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein accumulated and the molecular weight of expressed fusion protein was 141 kDa.

Takifugurubripes;SREBP-1 gene;SREBP-2 gene;Prokaryotic expression

2016-03-25

河南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(14A310027);新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院高學(xué)歷人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目(505001)

張偉(1977-),男,河南長(zhǎng)垣人,講師,博士,主要從事魚類脂質(zhì)代謝的機(jī)制研究。

S917;Q786

A

1000-7091(2016)04-0074-06

10.7668/hbnxb.2016.04.013