結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與MTHFR基因多態(tài)性及臨床病理特征的相關(guān)性

井昶雯，　曹海霞，　王　卓，　馬　蓉，　吳建中

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論著

結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與MTHFR基因多態(tài)性及臨床病理特征的相關(guān)性

井昶雯，曹海霞，王卓，馬蓉，吳建中

目的檢測結(jié)直腸癌標(biāo)本中微衛(wèi)星穩(wěn)定性及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因多態(tài)性，并探討兩者的相關(guān)性。方法用限制酶內(nèi)切法檢測52例結(jié)直腸癌標(biāo)本的MTHFR基因的多態(tài)性，應(yīng)用毛細(xì)管電泳法檢測微衛(wèi)星穩(wěn)定與否,統(tǒng)計MTHFR多態(tài)性、微衛(wèi)星穩(wěn)定性與臨床病理特征的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。結(jié)果微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌共14例(26.92%)，與結(jié)直腸癌患者年齡(χ2=0.051，P>0.05)、性別(χ2=0.083，P>0.05)和腫瘤分期(χ2=0.259，P>0.05)無相關(guān)性，而與腫瘤分化程度(χ2=6.361，P<0.05)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否(χ2=4.798，P<0.05)相關(guān)。MTHFR CC型29例，CT+TT型23例，兩組間結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。MTHFR C677T多態(tài)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性呈正相關(guān)性。結(jié)論MTHFR C677T多態(tài)與結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

結(jié)直腸癌；MTHFR；微衛(wèi)星穩(wěn)定性；基因多態(tài)性

隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率已居腫瘤類第三位，2014年新發(fā)病例31萬人、死亡15萬人，5年生存率為47.2%。微衛(wèi)星(microsatellite)是具有高度的個體特異性和穩(wěn)定遺傳性的由同一脫氧寡核苷酸重復(fù)串聯(lián)而成的序列，長度一般小于350 bp，重復(fù)順序為1～6 bp。主要分為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)[1]。NCCN指南(2012 V1)建議Ⅱ期結(jié)腸癌進(jìn)行氟尿嘧啶類單藥輔助治療前應(yīng)進(jìn)行MMR或MSI檢測。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶。677C→T是MTHFR最常見的突變，在第4外顯子677位點上的胞嘧啶C突變成為一個胸腺嘧啶T，纈氨酸突變?yōu)楸彼?，主要引起酶活性和熱穩(wěn)定性的改變，有可能影響5-氟尿嘧啶的化療療效[2]。本研究對52例結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行微衛(wèi)星穩(wěn)定性及MTHFR基因多態(tài)檢測，比較二者檢出率差異及相關(guān)性，為臨床結(jié)直腸癌患者施行個體化治療提供理論基礎(chǔ)。

1　資料和方法

1.1標(biāo)本來源

52例臨床病理資料完整的結(jié)直腸癌標(biāo)本來自江蘇省腫瘤醫(yī)院，于2012年1月10日至2013年12月15日期間在手術(shù)時采集。收取的標(biāo)本迅速置液氮罐內(nèi)保存，然后轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。?biāo)本均有對應(yīng)的癌旁組織(距癌組織5 cm以外的肺組織)，且經(jīng)病理學(xué)確診。

1.2試劑及引物

主要試劑：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit和QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN公司)、Taq HS酶(TaKaRa公司)、限制性內(nèi)切酶(NEB公司)、LIZ和HiDi(甲酰胺)均購置于ABI公司。

我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)報道，由TaKaRa公司合成微衛(wèi)星的PCR引物[3]，上游引物均以6-FAM標(biāo)記。具體序列見表1。

表1　微衛(wèi)星5個片段引物表

1.3檢測方法

1.3.1毛細(xì)管電泳法檢測MSI根據(jù)QIAamp DNA FFPE Tissue Kit操作手冊提取DNA：分別以腫瘤組織和癌旁組織DNA為模板，按表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，D2S123和D17S250由于片段大小相差較大，放置同一PCR管中反應(yīng)。體系：Taq HS mix 10μl，上下游引物(1 μmol/L)各1 μl，DNA模板100 ng，余用水補足至20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；60 ℃ 60 min；4 ℃冷卻。PCR產(chǎn)物純化：根據(jù)AxyPrepTMPCR Cleanup kit操作說明書進(jìn)行。取1 μl PCR純化產(chǎn)物與0.3 μl LIZ和9 μl HiDi混合，95 ℃變性5 min，將變性產(chǎn)物在ABI 3500測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。GeneMapper V4.1對結(jié)果進(jìn)行片段分析。

結(jié)果判讀：腫瘤組織與癌旁組織比較，5個片段均一致，為MSS；有1個片段缺失、延長或縮短，判為MSI-L(microsatellite instability-high)；有2個及以上為MSI-H(microsatellite instability-high)，具體圖形見圖1。

1.3.2MTHFR基因多態(tài)檢測按本實驗室前期研究方法[4]對MTHFR基因多態(tài)進(jìn)行檢測，步驟如下：

PCR擴(kuò)增：PCR引物序列 F：5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’；R：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’。

PCR體系：100 ng DNA，Taq HS mix 10 μl,引物(100 μmol/L)各1 μl，補足體系至20 μl。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物為246 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入HinfI限制性內(nèi)切酶反應(yīng)后于3%瓊脂糖凝膠中電泳。

結(jié)果分析：MTHFR C677T 3種基因型分別是：C/C(198 bp)；C/T(198 bp/175 bp)；T/T(175 bp)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件，用χ2 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，以雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1微衛(wèi)星穩(wěn)定性與臨床病理特征的關(guān)系

我們對52例結(jié)直腸癌中微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)和臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計分析。微衛(wèi)星穩(wěn)定的例數(shù)有38例(73.08%)，MSI陽性(包括MSI-H和MSI-L)14例 (26.92%)，如表2所示。年齡>60歲的患者有34例，其中MSI陽性 10例(29.41%)；男性患者28例中MSI陽性 8例(28.57%)；腫瘤中高分化33例中MSI陽性 5例(15.15%)；Ⅰ～Ⅱ期患者23例，MSI陽性 7例(30.43%)；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者22例，MSI陽性9例(40.91%)。據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，MSI陽性與結(jié)直腸癌患者年齡和腫瘤分期無相關(guān)性(均P>0.05)，而與腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否相關(guān)(P<0.05)。

注：橫坐標(biāo)為片段大小，縱坐標(biāo)顯示相對熒光強度。A顯示某患者診斷為MSI-L，圖上箭頭所指為腫瘤組織BAT 25位點相較癌旁組織出現(xiàn)雙峰；B、C顯示另一患者診斷為MSI-H，圖上箭頭所指為腫瘤組織BAT 25、BAT 26兩個位點出現(xiàn)異常主峰。圖1　毛細(xì)管電泳法檢測MSI結(jié)果圖

表2　微衛(wèi)星穩(wěn)定性與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系

2.2MTHFR C677T 三種基因型與臨床病理特征的關(guān)系

如表3所示，MTHFR CC基因型患者中，年齡>60歲的有17例；男性16例；腫瘤中高分化者18例；Ⅰ～Ⅱ期患者10例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者10例。而MTHFR CT+TT基因型組中，年齡>60歲的有17例；男性12例；腫瘤中高分化者有15例；Ⅰ～Ⅱ期患者13例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者12例。MTHFR CC型和CT+TT型兩組間，結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3　MTHFR C677T基因型與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系

2.3MTHFR C677T基因型與微衛(wèi)星穩(wěn)定性的相關(guān)性

MTHFR 677 CC基因型結(jié)直腸患者中MSI+例數(shù)為4例，而MSS例數(shù)為25例，CT+TT基因型組MSI+例數(shù)為10例，MSS有13例，CC基因型組MSI+比例(13.79%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CT+TT基因型組(43.48%)，通過校正χ2檢驗公式，χ2=4.335，P<0.05，說明MTHFR C677T多態(tài)與MSI+有正相關(guān)性。

3　討論

MSI是由于錯配修復(fù)蛋白缺失(MMR)，DNA復(fù)制修復(fù)異常產(chǎn)生堿基錯配，包括高不穩(wěn)定和低不穩(wěn)定。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的結(jié)直腸癌具有特殊的臨床病理參數(shù)，微衛(wèi)星不穩(wěn)定的腫瘤分化程度低，浸潤組織更深，較少有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較好與氟尿嘧啶等化療敏感性相關(guān)[5]。因此，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測對于判斷結(jié)直腸癌的預(yù)后及治療意義重大。在散發(fā)性結(jié)直腸癌中，MSI的發(fā)生率為10%～20%，MSI-H的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖活性低，腫瘤分化程度低，預(yù)后較好，對輔助化療藥物如氟尿嘧啶等不敏感[6]。在此次研究中，52例結(jié)直腸癌患者中，MSI陽性率為26.92%，稍高于文獻(xiàn)報道的15%～20%，可能與檢測人數(shù)和檢測方法不同有關(guān)。有些文獻(xiàn)檢測的是一兩個位點的穩(wěn)定性，我們通過ABI 3500測序儀進(jìn)行片段分析檢測了5個位點的穩(wěn)定性，更加敏感。另此次研究結(jié)果顯示，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否存在統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)性。這與GAFA等[7]的研究結(jié)果一致。

MTHFR基因位于染色體1p36.3，編碼蛋白的分子量為74.6 kDa。MTHFR作為葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，催化5，10-亞甲基四氫葉酸產(chǎn)生5-甲基四氫葉酸的還原反應(yīng)，產(chǎn)物5-甲基四氫葉酸作為葉酸甲基化的甲基供體，使同型半胱氨酸生成蛋氨酸，MTHFR為DNA、RNA和蛋白質(zhì)的甲基化提供甲基，參與嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成，影響正常的DNA代謝。MTHFR C677T多態(tài)性將導(dǎo)致MTHFR活性下降，影響DNA甲基化水平，阻礙DNA合成和修復(fù)過程[8]。而MTHFR基因突變能增加5-氟尿嘧啶的細(xì)胞毒性，提高敏感性，在多種腫瘤如結(jié)直腸癌、胃癌中，MTHFR基因多態(tài)可預(yù)示5-氟尿嘧啶的敏感性[9]。我們此次研究顯示，MTHFR CC型和CT+TT型兩組間，結(jié)直腸癌患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤分期和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無統(tǒng)計學(xué)差異。

惡性腫瘤的發(fā)生與癌基因、抑癌基因以及錯配修復(fù)基因等基因的突變及甲基化水平有關(guān)。而MSI是由于錯配修復(fù)蛋白缺失，DNA復(fù)制修復(fù)異常而產(chǎn)生，因此，我們推測MTHFR C677T多態(tài)性導(dǎo)致甲基化異?？赡芘c微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)。已有研究報道了直腸癌中MTHFR多態(tài)性與MSI的關(guān)系，但并沒有統(tǒng)一的結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)MTHFR 677T多態(tài)性增加了MSI陽性結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險[10]。而CLARIZIA等[11]認(rèn)為MTHFR C677T多態(tài)位點與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性并無相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，MSI陽性結(jié)直腸癌組MTHFR 677 CT+TT基因型的頻率顯著高于MSS結(jié)直腸癌組，提示MTHFR 677 CT+TT基因型與MSI密切相關(guān)。我們認(rèn)為，MTHFR基因多態(tài)性可能通過調(diào)節(jié)DNA合成和甲基化影響了錯配修復(fù)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致了微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性。但此次研究中我們并未涉及到錯配修復(fù)基因的檢測，兩者的關(guān)系還有機(jī)制需要下一步深入研究。

總而言之，我們研究了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和MTHFR C677T多態(tài)性與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸患者中MTHFR C677T多態(tài)性與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性相關(guān)，接下來我們還需要收集相關(guān)臨床資料，進(jìn)行隨訪分析，進(jìn)一步研究兩者與5-氟尿嘧啶的敏感性的關(guān)系。

[1]KLOOR M. Pathogenesis of microsatellite-unstable colorectal cancer. Evaluation of new diagnostic and therapeutic options[J]. Pathologe, 2013, 34 Suppl 2: 277-281.

[2]DELGADO P L,ALVAREZ A H,SALIDO R E,et al. MTHFR C677T polymorphism and anatomopathological characteristics with prognostic significance in sporadic colorectal cancer[J]. Pathol Res Pract, 2015, 211(12):989-995.

[3]BERG K D, GLASER C L,THOMPSON R E, et al. Detection of microsatellite instability by fluorescence multiplex polymerase chain reaction[J]. J Mol Diagn, 2000,2(1): 20-28.

[4]CAO H X, GAO C M,TAKEZAKI T,et al. Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase and susceptibility to colorectal cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2008, 9(2): 203-208.

[5]DE LA CHAPELLE A,HAMPEL H. Clinical relevance of microsatellite instability in colorectal cancer[J]. J Clin Oncol, 2010,28(20): 3380-3387.

[6]NIV Y. Biologic behavior of microsatellite-unstable colorectal cancer and treatment with 5-fluorouracil[J]. Isr Med Assoc J, 2005, 7(8): 520-524.

[7]GAFA R,MAESTRI I,MATTEUZZI M,et al. Sporadic colorectal adenocarcinomas with high-frequency microsatellite instability[J]. Cancer, 2000, 89(10): 2025-2037.

[8]GUENTHER B D, SHEPPARD C A,TRAN P, et al. The structure and properties of methylenetetrahydrofolate reductase from Escherichia coli suggest how folate ameliorates human hyperhomocysteinemia[J]. Nat Struct Biol, 1999, 6(4): 359-365.

[9]WANG Z,CHEN J Q,LIU J L,et al. Polymorphisms in ERCC1, GSTs, TS and MTHFR predict clinical outcomes of gastric cancer patients treated with platinum/5-Fu-based chemotherapy: a systematic review[J]. BMC Gastroenterol, 2012, 12: 137.

[10]HUBNER R A, LUBBE S,CHANDLER I,et al. MTHFR C677T has differential influence on risk of MSI and MSS colorectal cancer[J]. Hum Mol Genet, 2007, 16(9): 1072-1077.

[11]CLARIZIA A D, BASTOS R L,PENA H B,et al. Relationship of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism with microsatellite instability and promoter hypermethylation in sporadic colorectal cancer[J]. Genet Mol Res, 2006, 5(2): 315-322.

The relationship of microsatellite instability state with MTHFR polymorphism and clinical pathological characteristics in colorectal cancers

JINGChangwen1,CAOHaixia2，WANGZhuo1,MARong1,WUJianzhong1.

(1.ClinicalCancerResearchCenter，JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China； 2.EpidemiologicalResearchLaboratory，JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China)

Crrespondingauthor:WUJianzhong,E-mail:wujzh1528@126.com

ObjectiveThe aim of the study is to investigate the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability in the colorectal cancer, find the relationship between the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability. MethodsFluorescence-labelled primers PCR were applied to detect the microsatellite instability in 52 colorectal cancer patients. MTHFR C677T genotypes were detected by PCR-RFLP method.ResultsMicrosatellite instability positive cases were 14 and MSI was related to tumor differentiation degree and distant metastasis,but no significant correlation with sex,gender and clinical stage.MTHFR 667 site gene polymorphism distribution has no significant correlation with sex，gender，tumor differentiation degree, clinical stage, and distant metastasis but with microsatellite instability state.ConclusionThere is a relationship between the MTHFR gene polymorphism and microsatellite instability. Further study is needed to explore the mechanism.

Colorectal cancer；MTHFR；Microsatellite instability；Gene polymorphism

江蘇省衛(wèi)生廳面上科研項目(H201410)； 江蘇省腫瘤防治研究所院內(nèi)基金(ZM201106和 ZQ201205)

210004江蘇南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院臨床腫瘤實驗中心(井昶雯，王卓，馬蓉，吳建中)； 江蘇省腫瘤醫(yī)院流行病研究室(曹海霞)

井昶雯，女，助理研究員，主要從事腫瘤分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究工作,E-mail:jcw223200@163.com

共同第一作者： 曹海霞，女，副研究員，研究方向：腫瘤的流行病學(xué)，E-mail:pascallschx@126.com

吳建中，男，研究員，主要從事腫瘤分子生物的基礎(chǔ)研究工作，E-mail:wujzh1528@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.03.009

1674-4136(2016)03-0177-05

2015-12-28][本文編輯：欽嫣]