艾燃燒生成物化學(xué)評價與控制模型建立探索性研究

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(1 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)，北京，102618； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京,100029； 3 北京市藥品檢驗所，北京，102206)

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艾燃燒生成物化學(xué)評價與控制模型建立探索性研究

靳然1趙百孝2于密密3郭洪祝3傅欣彤3陳有根3

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)，北京，102618； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京,100029； 3 北京市藥品檢驗所，北京，102206)

目的:初步建立艾燃燒生成物化學(xué)評價與控制模型。方法:采用SPME-GC聯(lián)用技術(shù)對艾燃燒生成物進(jìn)行檢測，建立了艾燃燒生成物的指紋圖譜；運用matlab數(shù)學(xué)軟件提取既有樣品艾煙氣相色譜圖的29個共有峰進(jìn)行聚類，繪制出艾煙特征曲線；運用matlab數(shù)學(xué)軟件提取29個峰的信息進(jìn)行主成分分析。結(jié)果:艾燃燒生成物指紋圖譜和特征曲線2種方法計算得到的相似度結(jié)果相近，主成分分析中精細(xì)艾絨離聚類中心較遠(yuǎn)。結(jié)論:艾燃燒生成物指紋圖譜、特征曲線的測定及主成分分析可以將艾煙更全面的加以描述，可以進(jìn)一步綜合利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或遺傳算法將艾燃燒生成物的化學(xué)評價和控制模型進(jìn)行優(yōu)化。

艾燃燒生成物；化學(xué)評價與控制模型；特征曲線；主成份分析；指紋圖譜

艾灸療法是以艾絨為主要材料，點燃后在體表一定的部位進(jìn)行燒、灼、熏、熨，給人體以溫?zé)帷⑺幬锎碳ぷ饔?，以防治疾病的一種外治法。幾千年的臨床實踐證明其安全有效，但艾灸作用的效應(yīng)機制目前不完全清楚，一般認(rèn)為除溫?zé)?、光效?yīng)之外，艾絨燃燒生成的煙氣，可通過呼吸道及施灸部位作用于人體，起到一定的治療作用[1-3]。艾燃燒生成物是艾絨燃燒時生成的煙氣，文獻(xiàn)報道中有艾煙、艾灸生成物、艾燃煙、艾葉揮發(fā)性物質(zhì)等多種名稱。

艾燃燒生成物是艾灸療法起效的一個很重要的因素，所以對艾燃燒生成物即艾煙進(jìn)行系統(tǒng)研究尤為重要。艾煙的化學(xué)成分組成不但與其燃燒充分程度有關(guān)，還與艾絨質(zhì)量有關(guān)，如產(chǎn)地、存儲時間、制作比例等等。所以本研究收集大批量不同質(zhì)量的艾絨，采用SPME-GC聯(lián)用技術(shù)對艾燃燒生成物進(jìn)行檢測，建立艾燃燒生成物的指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上建立一個穩(wěn)定真實可靠的艾燃燒生成物的化學(xué)評價和控制模型。以期為艾灸診室空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)，為搭建艾灸臨床、科研的技術(shù)平臺和操作規(guī)范奠定基礎(chǔ)。

1　艾煙指紋圖譜研究

有關(guān)艾葉及艾煙的定性分析的文獻(xiàn)很多[4-11]，靳然等人[12-13]對艾葉及艾煙中的某幾個成分也進(jìn)行了定量測定，但是并不能反映艾煙的整體特征。中藥指紋圖譜[14]可以全面反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，為了將艾煙更全面的加以描述，進(jìn)行了艾煙指紋圖譜的研究。

1.1儀器與材料氣相色譜(GC，Agilent Technologies,6980N)，安捷倫毛細(xì)管柱(HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm)。Supelco固相微萃取手柄，萃取頭型號包括75 μm Carboxen/PDMS。定制密閉玻璃儀器(18.5L)，頂蓋有小孔，配有橡膠塞。

2007年不同比例艾絨(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)、2008年不同比例艾絨(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)、2009年不同比例艾絨(3∶1、5∶1、8∶1、15∶1)，2010年3∶1艾絨、2011年3∶1艾絨，原料均為蘄艾，產(chǎn)于湖北省蘄春縣，采摘于端午前后，由湖北省蘄春縣李時珍醫(yī)藥工作辦公室提供，河南南陽漢醫(yī)艾絨廠加工。16個不同產(chǎn)地艾葉(湖北蘄春、湖北襄樊、北京、陜西、江西、山西、安徽、甘肅、河北、遼寧、黑龍江、河南浙川、河南桐柏、河南鄭州、河南固始、河南安陽)，均采摘于2010年端午節(jié)當(dāng)天(2010年6月16日)，由北京市藥品檢驗所藥師鑒定為正品，由粉碎機加工成3∶1艾絨。市售艾絨：市售艾絨1(3∶1)，市售艾絨2(3∶1)，黃金艾絨1，黃金艾絨2，2003年12∶1艾絨，2005年5∶1艾絨，百笑灸艾絨，南陽陳艾條艾絨，蘇州艾條艾絨，同仁堂艾條艾絨，均購于市場。

1.2實驗方法及條件

1.2.1樣品制備稱取樣品0.25 g，放在18.5L的密閉容器中點燃，燃盡后待艾煙充滿玻璃缸，將萃取頭插入密閉容器萃取30 min。把飽和的纖維頭在GC進(jìn)樣口解析3 min,然后進(jìn)行GC檢測。

1.2.2氣相色譜條件柱溫采取程序升溫，起始溫度為30 ℃，保持3 min；以2 ℃/min升至100 ℃，保持2 min；以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；以8 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測器溫度：250 ℃；分流進(jìn)樣,分流比10∶1。

1.2.3實驗條件固相微萃取頭型號為75 μm Carboxen/PDMS；萃取時間30 min；解吸附溫度為220 ℃；解吸附時間定為3 min。

1.2.4方法學(xué)考察萃取頭在進(jìn)樣口解吸附后需再次萃取才可進(jìn)樣，所以精密度考察即重復(fù)性考察。分別取2009年3∶1艾絨0.2517、0.2518、0.2517、0.2519、0.2517、0.2518 g，按1.2.1方法進(jìn)行實驗，然后進(jìn)行GC檢測。測得艾煙中苯甲醛、苯酚、鄰位甲酚、萘的含量RSD%分別為1.9%、0.8%、1.9%、1.8%。實驗結(jié)果表明該方法重復(fù)性和精密度良好。

1.3實驗結(jié)果將各艾煙樣品色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004版)，生成共有指紋圖譜，相似度在88.7%～99.7%之間。艾煙指紋圖譜匹配圖見圖1。

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)是根據(jù)夾角余弦算法進(jìn)行相似度計算的[14]，有一定的局限性。在艾煙指紋圖譜基礎(chǔ)上，利用matlab數(shù)學(xué)軟件對色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，運用K-means算法、主成分分析法等對數(shù)據(jù)進(jìn)行建模分析。

2　艾煙特征曲線研究

運用matlab數(shù)學(xué)軟件提取既有樣品艾煙的氣相色譜圖的29個共有峰進(jìn)行聚類，并將4個偽品艾絨樣品艾煙和8個市售艾絨樣品艾煙與繪制的艾煙特征曲線進(jìn)行比較。

29個成分峰保留時間分別為：6.5 min，6.8 min，11.4 min(3-糠醛)，13.3 min，15.1 min，17.4 min(2(5H)呋喃酮)，20.7 min(苯甲醛)，21.2 min，22.6 min，23.0 min(苯酚)，23.3 min，25.9 min(D-檸檬烯)，28.3 min(鄰位甲酚)，28.7 min，29.9 min(對位甲酚)，30.5 min，30.8 min，34.1 min，35.0 min，36.9 min(萘)，37.3 min，37.9 min，40.9 min，43.6 min，46.2 min，47.8 min，48.8 min，51.3 min。

K-means算法是數(shù)據(jù)點到原型的某種距離作為優(yōu)化的目標(biāo)函數(shù)，利用函數(shù)求極值的方法得到迭代運算的調(diào)整規(guī)則[15]。K-means算法以歐氏距離作為相似度測度，采用誤差平方和準(zhǔn)則函數(shù)作為聚類準(zhǔn)則函數(shù)。使用艾煙指紋圖譜中所得色譜結(jié)果，運用Matlab軟件利用K-means方法分析計算，得出艾煙特征曲線。見圖4。

圖1　艾煙指紋圖譜匹配圖

圖2　艾煙生成對照圖譜

圖3　艾煙氣相總離子流圖

圖4　艾煙特征曲線

本實驗通過corrcoef函數(shù)計算各樣品(包括4個偽品艾葉制作的艾絨)與艾煙特征曲線的相似度，并與中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004版)計算的相似度進(jìn)行比較。見表1。由表1可知，2種方法計算得到的相似度結(jié)果相近。用K-means方法計算相似度低于95%的樣品有2007年15∶1艾絨，2009年15∶1艾絨，黃金艾絨1和黃金艾絨2和蘇州艾條艾絨等5個樣品。其共同特點除了蘇州艾條艾絨外，其他艾絨樣品的加工比例都較高；而蘇州艾條艾絨大部分是葉梗，所含葉肉部分較少；黃金艾絨1為網(wǎng)購產(chǎn)品，其精度較高，肉眼觀察幾乎不含葉肉組織，但其他艾絨樣品均含墨綠色葉肉組織。用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004版)計算所得相似度也是這5種較低，但均大于85%，而K-means方法中黃金艾絨的相似度極低。說明2種方法得到的相似度結(jié)果基本一致，而以歐氏距離計算相似度的K-means算法和以夾角余弦算法計算相似度的相似度軟件計算結(jié)果上略有差異。

3　艾煙主成分分析

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計分析方法，它對多變量表示數(shù)據(jù)點集合尋找盡可能少的正交矢量表征數(shù)據(jù)信息特征[15]。將表1中編號為1～31的樣品的色譜圖輸入matlab軟件提取29個峰的信息進(jìn)行主成分分析。

樣本相關(guān)矩陣R的特征值及貢獻(xiàn)率如下。

前3個樣本主成分累計貢獻(xiàn)率已達(dá)到92.8%，故只需取前3個主成分即可，得到樣本3個主成分為。

y1=0.076810405x1+0.18513043x2-0.012300812x3+0.005326342x4+0.17253542x5

+0.018965455x6+0.12233716x7+0.095492803x8-0.1145388x9

+0.006976188x10-0.034464233x11-0.23349492x12+0.15368579x13

+0.15485451x14+0.082569562x15+0.14994298x16+0.24272339x17

-0.26053417x18+0.16764416x19+0.12858307x20+0.021348821x21

+0.037441444x22+0.51264787x23-0.20130903x24-0.11471906x25

+0.041096926x26+0.27621576x27+0.22647269x28-0.37496969x29

y2=0.066031218x1+0.013347447x2-0.11207993x3-0.047906525x4-0.31919843x5

-0.13414489x6-0.21828088x7+0.053445272x8-0.058235083x9

-0.015083943x10-0.11224782x11+0.02993799x12+0.15648882x13

+0.018708408x14+0.23454219x15-0.2116186x16+0.021527488x17

+0.23053724x18-0.039812017x19+0.29989642x20-0.33023989x21

+0.32480296x22-0.1412456x23-0.12162914x24-0.14695852x25

+0.11241324x26+0.32702026x27-0.30058524x28-0.2061868x29

y3=0.3164807x1+0.60155755x2+0.16723998x3-0.40407914x4+0.1039996x5

-0.096246257x6+0.085433632x7-0.21366894x8+0.034076083x9

-0.3424418x10-0.002548368x11+0.052086554x12-0.20161788x13

-0.014323804x14+0.003088385x15+0.06752903x16-0.17508608x17

+0.10906743x18-0.14640093x19+0.07319825x20+0.031102782x21

-0.023370197x22+0.02634792x23-0.076330401x24-0.045713842x25

-0.086849011x26+0.043849532x27-0.010802703x28+0.13441336x29

圖5　主成分分析法樣本聚為1類

圖6　主成分分析法樣本聚為3類

表1　艾煙相似度

從3個樣本主成分可以看出，y1的貢獻(xiàn)率高達(dá)63.7%，y1和y2的累計貢獻(xiàn)率為87.3%，所以僅前2個主成分足以反映樣本的原始信息。將31個樣品信息代入y1和y2方程求值，并進(jìn)行聚類分析，分別將其聚為1類、 3類，如圖5、圖6。將表2中編號為32～43的樣品重新編號為1～12，將數(shù)據(jù)信息代入方程，在得到結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行檢驗。圖5的聚類中心以※1為標(biāo)記，聚類半徑為43.5，參與聚類的31個樣本在圖中以圓圈標(biāo)記○，待檢驗的12個樣本以星號☆標(biāo)記。圖6的3個聚類中心以※數(shù)字為標(biāo)記，其中參加聚類的31個樣本根據(jù)1、2、3類不同，分別以○、△、◇標(biāo)記，而待檢驗的12個樣本以☆標(biāo)記。

由圖5可知所有的艾煙樣品都聚在※1的四周，進(jìn)行檢驗的12個樣品中百笑灸艾絨、南陽陳艾條艾絨和黃金艾絨1離聚類中心較遠(yuǎn)，其余所有艾煙樣品(包括偽品艾葉制作的艾絨在內(nèi))差別不大，可能與艾絨的精度有關(guān)。由圖6可知，艾煙樣品以※1、2、3聚為3類，在分類上沒有明顯規(guī)律，但百笑灸艾絨、南陽陳艾條艾絨、黃金艾絨1和黃金艾絨2離聚類中心較遠(yuǎn)?？赡芤驗榫?xì)艾絨的樣本量偏少，所以離聚類中心較遠(yuǎn)，推測收集大量樣本的精細(xì)艾絨通過matlab的主成分分析法可以將不同精細(xì)度的艾絨分別聚類。

表2　特征值及貢獻(xiàn)率

4　艾燃燒生成物化學(xué)評價與控制模型的建立

根據(jù)艾煙指紋圖譜、特征曲線和主成分分析實驗結(jié)果，建立艾燃燒生成物的化學(xué)評價與控制模型。

4.1艾燃燒生成物的測定方法準(zhǔn)確稱量0.25 g艾絨，置于18.5L密閉容器中點燃，待其燃盡煙氣混勻后用75 μm CAR/PDMS型號固相微萃取頭萃取30 min,在進(jìn)樣口解吸附3 min,然后進(jìn)行GC分析。

色譜條件：安捷倫毛細(xì)管柱(HP-5,30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱溫采取程序升溫，起始溫度為30 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至90 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至105 ℃，以8.0 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測器溫度：250 ℃；分流進(jìn)樣,分流比10∶1。

4.2艾燃燒生成物指紋圖譜的測定將所得色譜圖輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件與圖2的生成對照圖譜進(jìn)行比較，相似度不得低于85%。

4.3艾燃燒生成物特征曲線的測定利用matlab軟件提取保留時間分別為6.5 min，6.8 min，11.4 min(3-糠醛)，13.3 min，15.1 min，17.4 min(2(5H)呋喃酮)，20.7 min(苯甲醛)，21.2 min，22.6 min，23.0 min(苯酚)，23.3 min，25.9 min(D-檸檬烯)，28.3 min(鄰位甲酚)，28.7 min，29.9 min(對位甲酚)，30.5 min，30.8 min，34.1 min，35.0 min，36.9 min(萘)，37.3 min，37.9 min，40.9 min，43.6 min，46.2 min，47.8 min，48.8 min，51.3 min的29個成分的信息，繪制艾煙特征曲線，并與圖4中生成的對照特征曲線進(jìn)行比較，相似度不得低于85%。

4.4艾燃燒生成物主成分分析艾煙3個主成分特征方程。

y1=0.076810405x1+0.18513043x2-0.012300812x3+0.005326342x4+0.17253542x5

+0.018965455x6+0.12233716x7+0.095492803x8-0.1145388x9

+0.006976188x10-0.034464233x11-0.23349492x12+0.15368579x13

+0.15485451xx14+0.082569562x15+0.14994298x16+0.24272339x17

-0.26053417x18+0.16764416x19+0.12858307x20+0.021348821x21

+0.037441444x22+0.51264787x23-0.20130903x24-0.11471906x25

+0.041096926x26+0.27621576x27+0.22647269x28-0.37496969x29

y2=0.066031218x1+0.013347447x2-0.11207993x3-0.047906525x4-0.31919843x5

-0.13414489x6-0.21828088x7+0.053445272x8-0.058235083x9

-0.015083943x10-0.11224782x11+0.02993799x12+0.15648882x13

+0.018708408xx14+0.23454219x15-0.2116186x16+0.021527488x17

+0.23053724x18-0.039812017x19+0.29989642x20-0.33023989x21

+0.32480296x22-0.1412456x23-0.12162914x24-0.14695852x25

+0.11241324x26+0.32702026x27-0.30058524x28-0.2061868x29

y3=0.3164807x1+0.60155755x2+0.16723998x3-0.40407914x4+0.1039996x5

-0.096246257x6+0.085433632x7-0.21366894x8+0.034076083x9

-0.3424418x10-0.002548368x11+0.052086554x12-0.20161788x13

-0.014323804xx14+0.003088385x15+0.06752903x16-0.17508608x17

+0.10906743x18-0.14640093x19+0.07319825x20+0.031102782x21

-0.023370197x22+0.02634792x23-0.076330401x24-0.045713842x25

-0.086849011x26+0.043849532x27-0.01080270x28+0.13441336x29

利用matlab提取所測艾煙氣相色譜圖的29個峰信息，進(jìn)行主成分分析，并將其標(biāo)準(zhǔn)化后的信息代入上述前2個方程中，聚類后應(yīng)在圖5的范圍內(nèi)，半徑為43.5。

5　討論

用SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)只能檢測到艾燃燒生成物中少量的揮發(fā)油成分[6]，可能與本方法測定艾煙取樣量較小有關(guān)。所以艾燃燒生成物的化學(xué)評價與控制模型的建立并沒有涉及到不同艾絨樣品揮發(fā)油成分，這可能是偽品所制艾絨與正品艾絨煙氣差別不大的原因之一。

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)是根據(jù)夾角余弦算法進(jìn)行相似度計算的，主要反映的艾煙的整體特征，有一定的局限性。而艾煙的特征曲線繪制是基于峰面積的檢測，反映的是艾煙中各成分的相對含量，所以艾煙特征曲線與指紋圖譜的測定可以將艾煙更全面的加以描述。

艾煙的主成分分析中，艾絨的樣本量偏少。精細(xì)艾絨離聚類中心較遠(yuǎn)，推測收集大量樣本的精細(xì)艾絨通過matlab的主成分分析法可以將不同精細(xì)度的艾絨分別聚類。該模型中的主成分分析特征方程中特征向量較多，可以綜合利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或遺傳算法將其進(jìn)一步精簡，將艾燃燒生成物的化學(xué)評價和控制模型進(jìn)行優(yōu)化。

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(2016-06-28收稿責(zé)任編輯：洪志強)

Exploratory Study on the Chemical Assessment and Control Model of Moxa Smoke

Jin Ran1, Zhao Baixiao2, Yu Mimi3, Guo Hongzhu3, Fu Xintong3, Chen Yougen3

(1Guang′anmenHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing102618,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 3BeijingInstituteforDrugControl,Beijing102206,China)

Objective:To establish a chemical assessment and control model for moxa smoke. Methods: Using SPME-GC technique to assess moxa smoke and establish a finger-print of that. At the same time, using matlab software to aggregate the 29 common peaks of current moxa smoke prints and draw a feature curve for moxa smoke, then analyze the main content. Results: The results retrieved by fingerprint and feature curve were identical, and the main content analysis showed that fine moxa has a far distance from the cluster center. Conclusion: Moxa smoke can be comprehensively analyzed by finger-print, feature curve and main content analysis. Artificial nerve-net or genetic algorithm can be used in optimizing the chemical assessment and control model.

Combustion Product of Moxa floss; Chemical evaluation and control model; characteristic curve; Principal component analysis; Fingerprint

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81373730)；國家自然科學(xué)基金項目(編號：81574068)；國家青年自然基金項目(編號：81403449)；國家國際科技合作專項項目(編號：2011DFA31370)

靳然(1982—)，女，主治醫(yī)師，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)針灸科

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.003