艾灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎性反應(yīng)因子及MMP-9的實(shí)驗(yàn)研究

哈　略　趙百孝

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029)

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專題——艾灸療法的作用機(jī)制及創(chuàng)新應(yīng)用

艾灸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎性反應(yīng)因子及MMP-9的實(shí)驗(yàn)研究

哈略趙百孝

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029)

目的：觀察艾灸對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的影響，并從抑制炎性反應(yīng)，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等角度探討艾灸在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的機(jī)制。方法：將48只采用高脂飲食喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)作為動(dòng)脈粥樣硬化模型，并隨機(jī)分為3組：艾灸組，模型組，藥物對(duì)照組。并將16只同齡相同遺傳背景的C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組?？瞻捉M、模型組小鼠每天常規(guī)抓取、固定，并放置假艾灸裝置。艾灸組小鼠每天抓取固定，并艾灸膻中穴。藥物組小鼠每天采用辛伐他汀0.28 mg/100 g灌胃，所有干預(yù)20 min/d，6 d/周，干預(yù)14周后犧牲，取材檢測(cè)。Elisa法測(cè)定主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α、IL-10、MMP-9的含量。油紅“O”染色觀察胸主動(dòng)脈病理改變。結(jié)果：1)與模型組相比，艾灸組，藥物組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α、MMP-9含量明顯降低(P<0.05)，艾灸組，藥物組之間無(wú)明顯差異；與模型組相比，藥物組IL-10水平明顯升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，艾灸組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)IL-10呈升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2)胸主動(dòng)脈病理改變：與空白組相比，模型組胸主動(dòng)脈可見(jiàn)明顯的AS斑塊，內(nèi)膜破壞，中膜增厚，平滑肌細(xì)胞破壞變性，管腔變狹窄。相比于模型組，艾灸組及藥物組主動(dòng)脈病變明顯減輕。結(jié)論：1)艾灸可以有效緩解動(dòng)脈粥樣硬化病變，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊生長(zhǎng)；2)艾灸可以抑制體內(nèi)炎性反應(yīng)，并具有穩(wěn)定斑塊的作用

艾灸；斑塊穩(wěn)定;動(dòng)脈粥樣硬化；炎性反應(yīng)因子

近年來(lái)，心血管疾病，包括冠心病、缺血性壞死、腹主動(dòng)脈瘤及眾多腦卒中、心力衰竭導(dǎo)致的死亡事件，已成為人類的首要威脅，而上述疾病的共同病理基礎(chǔ)均和動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)有關(guān)。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，AS造成的心腦血管事件已成為我國(guó)人民的主要死亡原因之一。AS是一種發(fā)生在大中動(dòng)脈附近的、以脂質(zhì)堆積、斑塊形成為特點(diǎn)的慢性病理過(guò)程，臨床上，AS的存在是多種心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。因此，探索AS的發(fā)病機(jī)制、研究其病理過(guò)程中的重要致病因素，可以指導(dǎo)臨床更好的控制心腦血管疾病。

在解釋AS發(fā)病機(jī)制的眾多假說(shuō)中，脂質(zhì)浸潤(rùn)假說(shuō)長(zhǎng)期占主導(dǎo)地位。這一現(xiàn)象一度持續(xù)了半個(gè)世紀(jì)[1]。1999年，ROSS在他先前提出的損傷反應(yīng)假說(shuō)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步完善其理論，認(rèn)為AS的病理過(guò)程是一種慢性炎性狀態(tài)，炎性反應(yīng)貫穿AS的始終[2]。雖然目前公認(rèn)LDL是AS的重要始動(dòng)因素，但在過(guò)去的20多年，免疫和炎性反應(yīng)機(jī)制越來(lái)越受到人們的重視[2-3]，越來(lái)越多的研究也充分證實(shí)了炎性反應(yīng)在AS過(guò)程中扮演著重要角色，這也是現(xiàn)階段AS相關(guān)研究的重要切入點(diǎn)。

目前，臨床上用于控制AS的藥物主要包括降血脂藥物，如苯氧酸類、煙酸類及他汀類；抗氧化劑及抗血小板聚集藥等，但長(zhǎng)期使用這些藥物，人體會(huì)產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)。因此，尋求更加安全的補(bǔ)充替代療法，也成為了對(duì)抗AS的必要途徑之一。

艾灸療法作為中醫(yī)療法的重要組成部分，長(zhǎng)期在人民的醫(yī)療和養(yǎng)生領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，國(guó)內(nèi)相關(guān)研究及本課題組前期研究均證明，艾灸可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪、膽固醇代謝等途徑和抑制炎性反應(yīng)等環(huán)節(jié)來(lái)抑制AS的病理發(fā)展。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在觀察艾灸對(duì)AS模型小鼠主動(dòng)脈病理、炎性因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的作用，探討艾灸在AS過(guò)程中的抗炎機(jī)制及其穩(wěn)定斑塊的作用。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用8周齡健康雄性載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)作為AS模型，同齡相同遺傳背景非轉(zhuǎn)基因野生C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照。小鼠均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，(飼料購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)，C57BL/6小鼠采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有小鼠均可自由進(jìn)食飲水；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃,濕度為50%～60%左右。采用人工控制室內(nèi)照明,保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8:00)交替循環(huán)。

1.2主要試劑和儀器1)特制細(xì)艾條：規(guī)格φ0.5 cm×20 cm,購(gòu)自河南南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限公司；2)辛伐他汀購(gòu)自廣東杭州默沙東制藥有限公司;3)小鼠固定器：規(guī)格150 mm×65 mm×50 mm，可固定小鼠頭、尾、四肢部位，底板處設(shè)有小孔，可暴露胸部，購(gòu)自上海華巖儀器設(shè)備有限公司；4)小鼠灌胃針：規(guī)格：12號(hào)總長(zhǎng)40 mm彎針，購(gòu)自北京百諾威生物科技有限公司；5)低溫離心機(jī)，德國(guó)ZK380型；6)超低溫冰箱，日本三洋公司產(chǎn)；7)電子天平，河南愛(ài)博科技發(fā)展有限公司LEICA CM1850冰凍切片機(jī)；8)Leica RM2235石蠟切片機(jī)；9)Leica冰凍組織包埋劑；10)Leica HI1220烤片機(jī)；11)Leica ST5020全自動(dòng)組織脫水機(jī)；12)顯微鏡：Nikon E200光學(xué)顯微鏡；13)拍照系統(tǒng)：佳能450D相機(jī)；14)Olympus bx51顯微鏡；15)腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)試劑盒，購(gòu)武漢華美生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào)(CSB-E04741m)；白細(xì)胞介素10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)試劑盒，購(gòu)武漢華美生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào)(CSB-E04594m)；基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)試劑盒，購(gòu)武漢華美生物工程有限公司，產(chǎn)品編號(hào)(CSB-E08007m)。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及處理將48只8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組：模型對(duì)照組，西藥組，艾灸組，每組16只。16只C57BL/6作為空白對(duì)照。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。干預(yù)14周后，犧牲取材，檢測(cè)指標(biāo)。

2.2干預(yù)方法空白組：將小鼠抓取、放入固定器，固定小鼠頭、尾、四肢部位(1次/d)。

模型組：將小鼠抓取、放入固定器，固定小鼠頭、尾、四肢部位(1次/d)。

西藥組：將小鼠抓取，采用辛伐他汀懸液灌胃2.8 mg/kg(1次/d)。

艾灸組：將小鼠抓取，放入固定器固定，固定小鼠頭、尾、四肢部位。固定完成后將固定器后架起，固定器底部設(shè)有小孔，暴露胸部膻中穴，點(diǎn)燃艾條并放置在小鼠胸部下方，使熱力通過(guò)固定器底部小孔傳至小鼠胸部膻中穴。在艾灸過(guò)程中，不斷調(diào)整艾條高度，使艾灸的溫度基本保持恒定。艾灸干預(yù)20 min/次，1次/d，6 d/周，共14周，在干預(yù)14周末犧牲小鼠，取材。

2.3取材及檢測(cè)末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h。每組隨機(jī)選取8只小鼠，測(cè)量體重后，用3.5%的水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉后，迅速剖開(kāi)胸部，暴露心臟，心臟取血后，使用20 mL注射器經(jīng)心尖偏左3～4 mm處進(jìn)針，插入左心室，并剪開(kāi)右心耳，灌注4 ℃ 0.9% NaCl溶液20～30 mL，待肺部、肝臟、腎臟顏色明顯變白，流出液體澄清后，從主動(dòng)脈弓起，沿脊柱分離主動(dòng)脈，沖洗，取出主動(dòng)脈。濾紙吸干后稱重100 mg,制成10%動(dòng)脈勻漿3 000 r/min離心10 min后取上清,保存于-80 ℃待測(cè)。剩余8只取出主動(dòng)脈后立即使用PBS緩沖液反復(fù)沖洗數(shù)次，放入4%多聚甲醛中固定24 h。選取胸腔主動(dòng)脈部位做油紅“O”染色。

胸主動(dòng)脈油紅“O”染色：

1)組織包埋與切片：固定后，進(jìn)行梯度蔗糖脫水，10%蔗糖2 h，20%蔗糖2 h，30%蔗糖直至組織沉底后取出，濾紙吸干殘余液體，投入LEICA冰凍組織包埋劑中浸泡5 min使氣泡排盡，使組織立于包埋臺(tái)，LEICA包埋劑包埋后立即速凍，使用LEICA CM1850冰凍切片機(jī)在恒溫-20 ℃環(huán)境下進(jìn)行6 μm冰凍切片，切片后自然風(fēng)干，準(zhǔn)備油紅“O”染色。

2)油紅“O”染色：切片蒸餾水浸洗5 min；60%異丙醇浸泡1 min；油紅“O”染色液浸染5 min，自來(lái)水沖洗掉殘余染色液；放入異丙醇內(nèi)分化至脂滴周邊組織無(wú)色后水洗終止。蘇木素復(fù)染3 min；氨水返藍(lán)后甘油封片指甲油封固后自然風(fēng)干。

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定主動(dòng)脈勻漿中的TNF-α、IL-10、MMP9，具體操作步驟如下：

1)將各種試劑移至室溫(18～25 ℃)環(huán)境中平衡，按前述方法配制試劑，備用。

2)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔。每孔分別加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37 ℃孵育2 h。

3)棄去液體，甩干，不用洗滌。

4)每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新的板貼，37 ℃孵育1 h。

5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

6)每孔加HRP-鏈酶親和素工作液100 μL，覆上新的板貼，37 ℃孵育1 h。

7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μL/孔，甩干。

8)每孔加底物溶液90 μL，覆上新的板貼，37 ℃避光孵育15～30 min。

9)依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。

10)在反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。

11)以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD值，計(jì)算出相應(yīng)的濃度。計(jì)算所得數(shù)值除以蛋白濃度為每mg蛋白中含有的樣品濃度。

3　結(jié)果

3.1主動(dòng)脈病理形態(tài)見(jiàn)圖1～圖4。

圖1　空白組(×10)

注：血管完好，內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)膜未見(jiàn)增厚，管腔大小正常，未見(jiàn)AS斑塊形成，細(xì)胞形態(tài)正常。

3.2主動(dòng)脈炎性反應(yīng)因子及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)水平

3.2.1各組主動(dòng)脈勻漿中TNF-α的含量比較各組主動(dòng)脈勻漿中TNF-α水平呈空白組<艾灸組<西藥組<模型組的趨勢(shì)。模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α含量顯著高于空白組(P<0.01)。與模型組相比，艾灸組、西藥組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α含量顯著低于模型組(P=0.022,0.003)；艾灸組與西藥組相比，TNF-α水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.377)。

圖2　模型組(×10)

注：可見(jiàn)主動(dòng)脈壁有明顯的斑塊形成，內(nèi)皮細(xì)胞破裂、內(nèi)膜增厚明顯，彈力纖維斷裂，中膜增厚、平滑肌細(xì)胞增生。粥樣硬化斑塊形成、斑塊內(nèi)可見(jiàn)較多脂肪滴，管腔狹窄。

圖3　西藥組(×10)

注：有斑塊形成，但病變較輕，內(nèi)皮細(xì)胞被破壞，但內(nèi)膜、中膜增厚不明顯，彈力纖維未斷裂，中膜完整。斑塊內(nèi)有明顯脂滴形成。

圖4　艾灸組(×10)

注：有斑塊形成，斑塊內(nèi)可見(jiàn)明顯脂滴，內(nèi)膜細(xì)胞被破壞，中膜增厚，部分中膜被破壞，彈力纖維斷裂。

3.2.2各組主動(dòng)脈勻漿中IL-10的含量比較各組主動(dòng)脈勻漿中IL-10水平呈正常組>西藥組>艾灸組>模型組的趨勢(shì)。與正常組相比，模型組小鼠血清IL-10含量顯著低于正常組(P<0.01)；與模型組相比，西藥組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)IL-10含量顯著升高(P<0.01)，艾灸組含量升高無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示有一定的升高趨勢(shì)(P=0.053)。

表1　各組主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α含量對(duì)比

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖5　各組主動(dòng)脈內(nèi)TNF-α含量對(duì)比(pg/mg)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

表2　各組主動(dòng)脈內(nèi)IL-10含量對(duì)比

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖6　各組主動(dòng)脈內(nèi)IL-10含量對(duì)比(pg/mL)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

3.2.3各組中動(dòng)脈勻漿中MMP-9的含量比較各組主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9含量表現(xiàn)為：空白組<艾灸組<西藥組<模型組。模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9含量顯著高于空白組(P<0.01)。與模型組相比艾灸組、西藥組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9含量顯著低于模型組(P=0.015,0.003)；艾灸組與西藥組相比，MMP-9水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.515)；具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3、圖7。

表3　各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9含量比較

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

圖7　各組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9含量比較(ng/mg)

注：與模型組相比*P<0.05;**P<0.01。

4　討論

TNF-α是肽介質(zhì)家族的一員，具有很強(qiáng)的促炎特性，在適應(yīng)性免疫、細(xì)胞增殖及凋亡的過(guò)程中扮演著重要角色。很多細(xì)胞都可以分泌TNF-α，如：巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞及纖維母細(xì)胞。TNF-α在AS中對(duì)脂質(zhì)具有質(zhì)量與數(shù)量的雙重影響，脂質(zhì)的這種持續(xù)被修飾，可推進(jìn)AS的不斷進(jìn)展。其對(duì)脂質(zhì)代謝的影響主要是通過(guò)降低膽固醇7α-羥化酶[4]及脂蛋白脂酶的分泌，及刺激肝臟生成三酰甘油[5-7]來(lái)實(shí)現(xiàn)的；而在炎性反應(yīng)過(guò)程當(dāng)中，TNF-α參與了AS過(guò)程當(dāng)中的全部階段，而AS過(guò)程中的每個(gè)階段都伴有不同程度的炎性反應(yīng)，TNF-α還可與其他炎性反應(yīng)因子，趨化因子一起形成協(xié)同作用，參與介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，血小板聚集，炎性反應(yīng)細(xì)胞的激活和聚集，以及血管壁內(nèi)部的炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而推動(dòng)AS的發(fā)展[6,8]。在AS的早期病變，TNF-α通過(guò)下調(diào)NO分泌、介導(dǎo)VCAM-1及ICAM-1而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增值[9]、上調(diào)各種趨化因子、半胱天冬酶，使內(nèi)皮損傷不斷加重。而在AS發(fā)展階段，TNF-α通過(guò)不斷誘導(dǎo)各種炎性反應(yīng)因子的分泌，加重AS過(guò)程中的炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。在AS的后期，TNF-α又能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP的含量，降低斑塊穩(wěn)定性，從而增加急性心血管事件的發(fā)生的幾率[10]。

白細(xì)胞介素10(IL-10)作為一種抗炎因子，主要由巨噬細(xì)胞及Th2亞型的T淋巴細(xì)胞分泌，它的主要功能包括抑制巨噬細(xì)胞活性、MMP和促炎因子的表達(dá)。研究表明持續(xù)的炎性反應(yīng)刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-10，從而抑制各種炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，如：IL-1、TNF-α、IL-8，并且誘導(dǎo)IL-1受體拮抗劑的增多[11-12]。同時(shí)，IL-10對(duì)MCP-1的抑制作用[13]，也被認(rèn)為是其對(duì)抗AS病理變化的重要機(jī)制。這2個(gè)指標(biāo)，是AS過(guò)程中的典型炎性反應(yīng)因子，一定程度上反映了炎性反應(yīng)的活躍程度。在本實(shí)驗(yàn)中，艾灸對(duì)TNF-α及IL-10的良性調(diào)節(jié)作用證明，艾灸膻中穴可以對(duì)小鼠AS過(guò)程產(chǎn)生廣泛的抗炎作用。

人類AS過(guò)程中，當(dāng)出現(xiàn)纖維帽變薄、SMC減少、脂類核心擴(kuò)大、鈣化、基質(zhì)重組等特征時(shí)，斑塊就會(huì)不穩(wěn)定[14]，從而為急性心血管事件的發(fā)生創(chuàng)造條件。當(dāng)斑塊受到外力時(shí)，承受其機(jī)械應(yīng)力的部位就是纖維帽，主要有膠原纖維、蛋白多糖、彈性蛋白組成。纖維帽的完整性與抗機(jī)械力的作用于EMC密不可分；而膠原纖維是構(gòu)成EMC的核心物質(zhì)，有SMC合成，MMPs降解。MMPs升高后，對(duì)膠原纖維的分解作用加強(qiáng)，導(dǎo)致纖維帽變薄，再加上血流動(dòng)力學(xué)的應(yīng)激變化，最終使斑塊發(fā)生破裂，故認(rèn)為MMPs增多與斑塊不穩(wěn)定性密不可分[14-15]。MMP-9主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，分泌的形式是前酶原形式?？梢灾苯幼饔糜谘軆?nèi)皮基底膜IV型膠原，導(dǎo)致其分解。本實(shí)驗(yàn)觀察艾灸對(duì)ApoE-/-小鼠MMP-9的影響，在國(guó)內(nèi)尚屬首例，結(jié)果表明，與模型組相比，艾灸能顯著降低主動(dòng)脈內(nèi)MMP-9的含量，提示艾灸在促進(jìn)斑塊穩(wěn)定性上有積極的干預(yù)效果。但由于MMP-9受多種細(xì)胞因子影響，艾灸對(duì)其調(diào)控的具體機(jī)制還不得而知，可能是基于其對(duì)其他炎性反應(yīng)因子的抑制，影響MMP-9的分泌，或者是另外單獨(dú)的調(diào)控通道，這有待下一步更細(xì)致的研究。

艾灸，作為一種中醫(yī)外治法。一般我們認(rèn)為其起效因素主要有以下3點(diǎn)：1)艾燃燒生成物本身的藥理作用；2)艾灸燃燒產(chǎn)生的物理作用，光熱效應(yīng)；3)經(jīng)絡(luò)穴位自身的調(diào)控作用。

首先我們來(lái)看下穴位的功效，在本研究中，所選用的膻中穴主治上焦病癥，是經(jīng)絡(luò)腧穴理論中的重要穴位之一，對(duì)其進(jìn)行刺激，可以增強(qiáng)上焦的氣化功能，乃至全身的氣化功能，促進(jìn)水谷的輸布，減少痰、瘀等病理產(chǎn)物的形成和堆積。而穴位本身所具有的寬胸理氣，行氣活血的功效，可以增強(qiáng)AS過(guò)程中有害因子的代謝和輸送，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善病理環(huán)境，這是穴位自身的功效。

溫?zé)岽碳な前寞煼ǖ闹饕饔脵C(jī)制之一，其溫通經(jīng)脈、活血化瘀的功效也正是通過(guò)溫?zé)岽碳さ姆绞絹?lái)實(shí)現(xiàn)的，炎性反應(yīng)過(guò)程中的紅、腫、痛等特征也符合中醫(yī)理論中“瘀”的表現(xiàn)，而艾灸正是通過(guò)活血化瘀的作用來(lái)疏通血脈，使局部或者機(jī)體內(nèi)瘀滯的氣血得以流通，改善組織代謝，調(diào)節(jié)微循環(huán)，促進(jìn)病理產(chǎn)物的排除。施灸局部是艾灸作用的直接對(duì)象,是艾灸溫通效應(yīng)啟動(dòng)機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中，艾條點(diǎn)燃后直接放置于胸部穴位，熱力可以穿透胸腔，直達(dá)心脈，因此，除了穴位本身的治療作用以外，艾灸的溫?zé)嵝?yīng)是本次研究的重要渠道。

艾燃燒生成物是艾灸的起效因素之一，研究組前期觀察不同濃度艾煙對(duì)大鼠血清VCAM-1、ICAM-1、hs-CRP的作用，結(jié)果表明三種濃度的艾煙均能降低這三種指標(biāo)的水平[16]。而對(duì)AS模型的ApoE-/-小鼠，艾煙能抑制其血清中黏附分子、趨化分子，炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，在AS過(guò)程中發(fā)揮其抗炎的作用[17]。本次實(shí)驗(yàn)，雖然沒(méi)有單獨(dú)設(shè)立艾煙干預(yù)組進(jìn)行對(duì)比，但艾煙在治療過(guò)程中的作用也不可忽視。另外，課題組前期證明，艾煙可以通過(guò)嗅覺(jué)通路通路至下丘腦海馬，起到抑制ROS、TNF-α，抑制炎性反應(yīng)；艾煙本身含有大量的揮發(fā)油和芳香物質(zhì)，筆者設(shè)想，艾煙能通過(guò)嗅覺(jué)通路進(jìn)入顱內(nèi)，影響腦內(nèi)活動(dòng)，調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)，通過(guò)心叢神經(jīng)，作用于心血管系統(tǒng)，可能也是其起效途徑之一，此假設(shè)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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(2016-06-28收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Experimental Study of Moxibustion′s Effect on Inflammatory Factors and MMP-9 of Arteriosclerosis Mice

Ha Lue, Zhao Baixiao

(SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuinaofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of moxibustion on TNF-α, IL-10 and MMP-9 of arteriosclerosis mice and discuss its possible mechanism from the angle of inhibiting inflammatory factors and stabilizing plague. Methods: To establish atherosclerosis model by removing ApoE gene through high-fat diet feeding. A total of forty-eight ApoE-/-mice (8 weeks old) were randomly divided into moxibustion group, model group, and medicine control group. Additionally, sixteen same age C57BL/6 mice were used as a blank control. Mice in the blank control and model control group were handled and intervened with sham moxibustion every day. Mice in the moxibustion group were handled and treated with moxibustion on Dan Zhong (RN17) acu-point while the mice in medicine control group were intervened by gavage Simvastatin 0.28 mg/100 g. All the interventions were given 20 min/day, 6 days/week, 14 weeks totally. Then the mice were killed for examination. Elisa method was used to test the level of TNF-α, IL-10, and MMP-9 and red oil “O” stain were used to observe the plague size in the aorta. Results: 1)Compared with the model group, TNF-α, MMP-9 levels of moxibustion group and medicine control group were decreased significantly (P<0.05), and there is no significant difference between the moxibustion group and medicine control group. Compared with the model group, IL-10 levels were increased significantly (P<0.05) in medicine control group. Despite IL-10 levels in moxibustion group showed a trend of increase, no significant difference was shown. 2)The pathological changes in the thoracic aorta plaque: Compared with the blank group, plague in model group can be obviously seen in the thoracic aorta, pathological changes including intimal destruction, medium thickness, smooth muscle cell degeneration, lumen stenosis can also be seen in the model group. Compared with model group, aortic lesions in moxibustion group and medicine group were significantly reduced. Conclusion: 1)Moxibustion could alleviate atherosclerosis, inhibit the growth of plague. 2)Moxibustion could inhibit inflammation in the body, which may be one of the mechanisms of its anti-atherosclerosis effect. Besides, moxibusion also contributes to plaque stability.

Atherosclerosis; Inflammation factors; Moxibustion; Plaque stability

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81373730)；國(guó)家青年自然基金項(xiàng)目(編號(hào)：81403449)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81574068)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2011DFA31370)

哈略(1989.04—)，2013級(jí)在讀碩士研究生，研究方向：艾灸與艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制，E-mail：halue@126.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院院長(zhǎng)，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.001