納米孔技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的研究新突破

張獻(xiàn)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530000

納米孔技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的研究新突破

張獻(xiàn)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530000

目的 探討納米孔技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的研究新突破。方法 應(yīng)用氮化硅材料納米孔芯片，初步研究金納米棒及BSA易位行為，建立應(yīng)用納米孔檢測納米顆粒樣品及蛋白質(zhì)生物分子樣品方法，統(tǒng)計分析納米顆粒的易位信號及蛋白質(zhì)分子信號；按照實驗所獲得的易位信號，總結(jié)常見的易位信號類型；按照實驗結(jié)果模擬固態(tài)納米孔內(nèi)電場及納米孔周圍電場，獲得不同電壓下同一納米孔的電場強(qiáng)度比較。結(jié)果 實驗選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號圖；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號如圖2；400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多；激發(fā)波長為280 nm時，BSA在自然折疊態(tài)時內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性；蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號圖：BSA加入后，電流基線較波動，后出現(xiàn)易位信號，蛋白質(zhì)易位時間的長短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號峰頂端較尖。結(jié)論氮化硅納米孔檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用為后續(xù)的納米孔傳感器在蛋白質(zhì)研究中提供理論及實驗基礎(chǔ)。

實驗研究；信號檢測；BSA；固態(tài)納米孔

隨著近年來納米孔檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，固態(tài)納米孔因其尺寸極易掌握，且其穩(wěn)定性較佳，是科學(xué)研究的熱點內(nèi)容，但對于檢測蛋白質(zhì)等生物大分子和變性劑與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系研究則較少[1]。鳥叔是蛋白質(zhì)變性劑的常見類型之一，可促使蛋白質(zhì)變性，有助于蛋白質(zhì)的解折疊及折疊機(jī)制進(jìn)行了解；血清白蛋白主要進(jìn)行PH值及血液滲透壓的調(diào)節(jié)，同時可運(yùn)送類固醇、氨基酸、脂肪酸等多種物質(zhì)[2]。牛血清蛋白是體積較大的球蛋白，其水溶性將，可用于研究蛋白質(zhì)變性機(jī)制。本研究探析應(yīng)用固態(tài)納米孔檢測技術(shù)研究經(jīng)尿素變性的BSA及BSA的易位行為，效果滿意，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

中國電子集團(tuán)第55研究所制備納米孔芯片、氮化硅薄膜，南京大學(xué)固體微結(jié)構(gòu)國家重點實驗室的聚焦粒子束加工系統(tǒng)完成刻蝕納米孔；在pH7.0的PBS溶液內(nèi)溶解BSA白色粉末，獲得BSA樣品溶液，檢測前在已過濾的1M氯化鉀溶液內(nèi)稀釋樣品溶液，配制成檢測工作液，分成小份，在-20°C冰箱內(nèi)置存，另取工作液加入已過濾的尿素6 M，待變性后為另一檢測液；超純水中溶解尿素粉末，配制出0 M、1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6 M、7 M、8 M濃度的溶液，與相同濃度的蛋白質(zhì)相互作用，為紫外熒光檢測的溶液；氯化鉀7.45 g在100 mL超純水內(nèi)溶解，配制為1 mol/L的氯化鉀溶液，實驗前應(yīng)用0.02 μm濾膜過濾；聚二甲基硅烷PDMS、乙醇、30%雙氧水溶液500 uL加入試管內(nèi)，加入濃硫酸1500 uL，混勻充分。

1.2 主要實驗儀器

電位粒度分析儀（N4PLUS）、熒光光譜儀。水浴鍋、氮?dú)馄?（流體和干燥芯片）、Anotop0.02 um濾膜（Whatman）、Ag/AgCl自制電極，自制微流體裝置，自制屏蔽箱（屏蔽特性：130×85×65 cm3＞60 dB），膜片鉗放大器（Axopatch 700 B）。

1.3 實驗方法

①制備芯片：熱氧化硅晶圓后在上下兩面生長約100 nm厚的二氧化硅薄膜，低壓氣象化學(xué)沉積法（LPCVD）在兩面分別沉積500 nm及100 nm厚的氮化硅薄膜，光刻膠涂于500 nm厚的氮化硅面，曝光后予以反應(yīng)離子刻濁（RIE），形成500 um×500 um的正方形窗口；氫氟酸濕法進(jìn)行腐蝕，至表面氮化硅層停止，形成100 nm厚的自支撐氮化硅薄膜，應(yīng)用聚焦粒子束加工系統(tǒng)予以打孔，按照粒子束大小和打孔時間評估納米孔孔徑的制備大小情況；②芯片表征：檢測氮化硅薄膜是否完整，表征方法暴露制備伏安特性曲線及顯微鏡下觀察評估納米孔的電化學(xué)特性；③實驗前處理流體及芯片：離心管加滿2 mL超純水，將芯片放入后初洗，后放入新配置的1.2 mL食人魚溶液的玻璃燒杯內(nèi)，90°C水浴內(nèi)放入燒杯30 min，燒杯取出，自然冷卻至室溫，后取出芯片，應(yīng)用大量超純水沖洗，芯片沖洗后放入裝有超純水的離心管內(nèi)置存?zhèn)溆?；每次?yīng)用前應(yīng)用吸水紙水分吸干或氮?dú)獯蹈?；超純水徹底清洗PDMS密封墊片及流體裝置，超聲清洗30 min，氮?dú)獯蹈?；④配制不同濃度的KCl電解液及樣品溶液：超純水中溶解蛋白質(zhì)BSA粉末配制為1 mM的樣品溶液，根據(jù)需要稀釋至50 nM、100 nM、500 nM、1 uM、2 uM、5 uM、10 uM、50 uM、100 uM、500 uM等不同濃度，分裝為小份在-20°C下置存；配制KCl濃度為1M電解質(zhì)溶液，根據(jù)需要稀釋至濃度為0.1 M及0.4 M，過濾備用；⑤組裝檢測裝置：在PDMS密封墊上放置納米孔芯片，左右流體部分放入鋁制模具內(nèi)，螺栓旋緊固定；為避免加樣過程中出現(xiàn)氣泡，PDMS膠固定兩根特氟龍軟管，1 mL注射器插入特氟龍軟管內(nèi)部加樣；⑥檢測樣品易位信號及分析：樣品溶液加完后，將一對Ag/AGCl自制電極放入兩根特氟龍軟管內(nèi)，流體裝置放入大屏蔽箱內(nèi)，電極另一端接好膜片鉗放大器探頭，注意電極對應(yīng)；施加電壓后，膜片鉗放大電流信號，經(jīng)由數(shù)據(jù)采集卡顯示于上位機(jī)顯示屏。偏置電壓，樣品濃度改變，改變濕度、溫度、電解液KCl濃度改變納米孔對蛋白質(zhì)BSA檢測調(diào)節(jié)，得到蛋白質(zhì)BSA過孔信號。應(yīng)用膜片鉗自帶軟件Clampfit0.3分析記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 易位信號的統(tǒng)計分析

實驗選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號圖（圖1）；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號如圖2；400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多。

圖1 固態(tài)納米孔檢測蛋白質(zhì)BSA分子 a：裝置示意圖；b：I-V曲線；c：過孔信號圖

圖2 蛋白質(zhì)BSA不同電壓下易位信號統(tǒng)計分析a：電流變化幅值-易位時間散點圖；b：易位事件-標(biāo)準(zhǔn)事件數(shù)柱狀圖；c：阻塞電流-標(biāo)準(zhǔn)事件數(shù)柱狀圖

2.2 蛋白質(zhì)BSA與尿素相互作用的熒光光譜分析

激發(fā)波長為280 nm時，BSA在自然折疊態(tài)時內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性，見圖3。

圖3 不同濃度尿素與蛋白質(zhì)BSA相互作用的熒光光譜圖

2.3 經(jīng)尿素變性后蛋白質(zhì)BSA的固態(tài)納米孔檢測結(jié)果分析

蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號圖（圖4）：BSA加入后，電流基線較波動，后出現(xiàn)易位信號，蛋白質(zhì)易位時間的長短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號峰頂端較尖。

圖4 固態(tài)納米孔檢測經(jīng)尿素變性后的BSA及BSA原始信號及單個易位信號

3 討論

每個新制備成的氮化硅納米芯片均需經(jīng)過電學(xué)特性的表征及觀察電子顯微鏡，因在預(yù)處理及制備芯片的過程中，薄膜極易出現(xiàn)破裂，在實驗過程前如無法較佳的檢測到芯片薄膜的完整性而直接應(yīng)用于實驗，可引發(fā)安裝芯片后發(fā)生電流過載[3]；蛋白質(zhì)與各種形式的生命及生命活動密切相關(guān)，它是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)[4]；機(jī)體的每個細(xì)胞全部重要組成部位均有蛋白質(zhì)的參與；蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，有一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)由一級結(jié)構(gòu)向更高級的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變方式主要是蛋白質(zhì)折疊，如蛋白質(zhì)出現(xiàn)折疊錯誤會嚴(yán)重影響機(jī)體的功能[5]，因此，檢測蛋白質(zhì)及分析其結(jié)構(gòu)十分重要。目前，檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方式有多種，如X射線晶體學(xué)，痛感檢測蛋白質(zhì)分子在晶體中電子密度的空間分布評估蛋白質(zhì)中所有原子的三維坐標(biāo)[6]；對于已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測還可通過圓二色譜及核磁共振等方式，但操作方法較為復(fù)雜，檢測成本較高；納米孔計數(shù)為新型單分子檢測熱點，可應(yīng)用于高靈敏度的蛋白質(zhì)檢測[7]。

本研究探析納米孔技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的研究新突破，結(jié)果顯示：實驗選擇孔徑為78 nm的固態(tài)納米孔檢測蛋白質(zhì)BSA，將溶于1M KCl溶液內(nèi)的樣品，加入至流體內(nèi)，偏置電壓變換獲得BSA分子過孔信號圖；選擇76 nm的納米孔在980 mV、900 mV、400 mV電壓下檢測12 nm的蛋白質(zhì)BSA分析易位結(jié)果，易位事件的原始信號如圖2； 400 mV電壓下納米孔與蛋白質(zhì)的相互作用較強(qiáng)，易位事件相對較為分散，而980 mV及900 mV電壓下，納米孔與蛋白質(zhì)分子的作用時間較短，分子過孔速度較快，出現(xiàn)的易位事件也較多；激發(fā)波長為280 nm時，BSA在自然折疊態(tài)時內(nèi)源熒光發(fā)射峰的最大發(fā)射波長位于346 nm附近，說明色氨酸殘基部分被隱藏；隨著尿素濃度的升高，BSA的相對熒光強(qiáng)度逐漸下降，出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象，說明BSA及尿素發(fā)生作用，導(dǎo)致BSA變性，但在0～5 M時，蛋白質(zhì)出現(xiàn)部分變性，6 M后，峰值出現(xiàn)顯著紅移，BSA完全變性；蛋白質(zhì)BSA和經(jīng)尿素變性后的BSA易位原始信號圖：BSA加入后，電流基線較波動，后出現(xiàn)易位信號，蛋白質(zhì)易位時間的長短，與BSA與孔的作用及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)；加入經(jīng)尿素變性的BSA后，電流基線總體穩(wěn)定但變細(xì)，易位信號峰頂端較尖，與范勇等[8]的研究結(jié)果大體一致，納米孔測序為近年來飛速發(fā)展的測序技術(shù)之一，納米孔是在薄膜上組裝或制備的納米級空隙，尺寸約在0.1～0.01納米量級之間，其基本檢測原理為含有納米孔的薄膜將一定pH值及一定濃度的電解質(zhì) （常為氯化鉀溶液）分為兩部分，電解質(zhì)溶液中溶解待檢測樣品，在兩個腔室間施加電場，電場經(jīng)由納米形成一定的開孔粒子電流，在電場的作用下，帶電顆粒由一端腔內(nèi)穿過納米孔，遷移至另一端腔室[9-10]；在穿孔時，因樣品顆粒會占據(jù)部分納米孔空間，原來可通過納米孔的部分離子無法通過，引發(fā)開孔離子電流急驟降低，出現(xiàn)了阻塞電流；即為檢測了樣品顆粒的易位事件；在理想的狀態(tài)下，因各種檢測樣品的結(jié)構(gòu)及尺寸具有一定的差異，在穿孔過程中對孔的阻塞程度也會有所不同，檢測到的阻塞電流大小也不同，可反映出樣品顆粒的表面性質(zhì)、形狀、大小等特征屬性；牛血清蛋白主要由一個自由半胱氨酸基團(tuán)、17個二硫鍵、607個氨基酸殘基組成，是較大的螺旋形結(jié)構(gòu)；其氨基酸較多可用于電離，同時水溶性又較高，可用于研究蛋白質(zhì)的變性機(jī)制；樣品加入電解質(zhì)溶液中后，基線電流開始出現(xiàn)一些尖峰，每個尖峰對應(yīng)一個蛋白質(zhì)BSA分子的易位事件；固態(tài)納米孔檢測1 M氯化鉀樣品溶液中3 uM BSA分子的直徑大小約為12 nm，熒光光譜分析蛋白質(zhì)BSA的完全變性時的尿素濃度，即6 M濃度尿素對蛋白質(zhì)變性可完全變性；而電壓較小時，納米孔孔壁與蛋白質(zhì)的相互作用時間較長，出現(xiàn)的易位事件不多，阻塞電流也相對較?。浑S著電壓的升高，蛋白質(zhì)與孔壁的作用時間越短，在高壓時也出現(xiàn)可相應(yīng)結(jié)構(gòu)改變，阻塞電流相應(yīng)增大，偏置電壓的大小對周圍區(qū)域及孔的電場產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響易位過程。綜上所述，氮化硅納米孔檢測蛋白質(zhì)應(yīng)用為后續(xù)的納米孔傳感器在蛋白質(zhì)研究中提供理論及實驗基礎(chǔ)。

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