大鼠肺間質(zhì)纖維化造模的2種方法比較研究

閆　莉，謝艷華，楊　倩，王四旺*，崔嘉輝，吳讓鑫

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安　710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，西安　710032)

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大鼠肺間質(zhì)纖維化造模的2種方法比較研究

閆莉1，謝艷華1，楊倩1，王四旺1*，崔嘉輝2，吳讓鑫2

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室，西安710032;2.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅，西安710032)

目的探討氣管和腹腔注射2種給藥方式復(fù)制特發(fā)性肺纖維化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)大鼠模型的差異。方法240～260g雄性SD大鼠24只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為氣管對照組(QC組)、氣管給藥組(Q組)、腹腔對照組(FC組)和腹腔給藥組(F組)，每組 6 只。分別經(jīng)氣管一次性注射生理鹽水0.2mL或博萊霉素(BLM)5mg·kg-1·d-1；腹腔注射生理鹽水0.2mL或博萊霉素15mg·kg-1·d-1，連續(xù)10d。28d后處死。觀察每組小鼠生存率、體質(zhì)量、肺臟外觀、病理改變及肺組織羥脯氨酸含量。結(jié)果Q組生存率為66.7%；F組生存率為83.3%，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2種方法給藥組大鼠體質(zhì)量均減輕，F(xiàn)組動物體質(zhì)量在1～7d內(nèi)下降，第8天起開始恢復(fù)；Q組動物體質(zhì)量在前15d內(nèi)持續(xù)下降，第16d起開始恢復(fù)。2種方法給藥組的肺臟外觀基本相同，沒有顯著差別。病理檢查證實(shí)，Q組的膠原纖維沉積主要分布在氣管周圍，而F組的膠原沉積則分布在胸膜和肺間質(zhì)。2種方法復(fù)制的模型組肺組織羥脯氨酸含量均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；模型組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論氣管給藥與腹腔給藥對于復(fù)制大鼠IPF無明顯差別，但氣管給藥法更方便、經(jīng)濟(jì)和可靠。

博萊霉素；肺間質(zhì)纖維化；造模

肺纖維化是指在不同因素刺激下引起肺部炎癥反應(yīng)，肺泡持續(xù)損傷，細(xì)胞外基質(zhì)被反復(fù)破壞、修復(fù)、重建并過度沉積，最終導(dǎo)致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的一類疾病，是所有間質(zhì)性肺病的終末結(jié)局。特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化 (Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)中的特發(fā)性指發(fā)病原因不明，占所有間質(zhì)性肺病的65%左右，嚴(yán)重威脅人類健康，但其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未明了，臨床上仍缺乏有效的治療手段，病死率高[1-8]。因此，建立肺纖維化大鼠模型，對進(jìn)一步探索該疾病的發(fā)病機(jī)制、評價治療新藥具有重要意義。

截至目前，利用博萊霉素(bleomycin，BLM)可致肺纖維化的毒性不良反應(yīng)，復(fù)制嚙齒動物肺纖維化，用來研究IPF，是最普遍和最經(jīng)典的動物模型[9-14]。常用的給藥方法有：支氣管給藥，腹腔注射和尾靜脈注射。因給藥方法不同，復(fù)制IPF的成模率、成本及其病理變化特點(diǎn)尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；然而，良好的動物模型是疾病研究和新藥研發(fā)的基礎(chǔ)，故本文依據(jù)簡便操作和經(jīng)濟(jì)的原則，重點(diǎn)比較研究了腹腔和氣管給予博萊霉素建立肺間質(zhì)纖維化模型的差異，為進(jìn)一步探索IPF發(fā)病機(jī)制和篩查有效治療藥物提供方便、經(jīng)濟(jì)和可靠的動物模型。

1　儀器與材料

1.1儀器電子天平(丹佛儀器公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海啟前電子科技有限公司)；離心沉淀機(jī)、小型高速冷凍離心機(jī)(賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；半自動生化儀(西化儀北京科技有限公司)；照相用顯微鏡(日本Oylmpus公司)。

1.2試藥注射用鹽酸博萊霉素(15mg·支-1，日本化藥株式會社，生產(chǎn)批號：730342)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；多聚甲醛(優(yōu)級純，北京化工廠)；生理鹽水(山東康寧藥業(yè)有限公司)；羥脯氨酸(Hyp)測定試劑盒(酸水解法，南京建成生物工程有限公司)；無水乙醇(分析純，北京化工廠)；水為實(shí)驗(yàn)室雙蒸水。

1.3動物健康SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量240～260g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號：SCXK(陜)2014-002。

2　方法

2.1動物分組24只雄性SD大鼠，購回后寄養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所藥理實(shí)驗(yàn)室SPF級動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)3d[2]后，分成4組，每組6只，均于第28天處死。分別為氣管對照組(QC組)：第0天氣管內(nèi)注射生理鹽水0.2mL；氣管給藥組(Q組)：第0天氣管內(nèi)注射博萊霉素5mg·kg-1·d-1，0.2mL；腹腔對照組(FC組)：第0天起腹腔注射生理鹽水0.2mL，連續(xù)10d；腹腔給藥組(F組)：第0天起腹腔注射博萊霉素15mg·kg-1·d-1，0.2mL，連續(xù)給藥10d。2.2動物模型的制備氣管給藥具體操作方法：①以體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛按照0.3mL·100g-1腹腔內(nèi)注射麻醉動物。剃除動物前部頸毛。②將動物固定于操作臺中的鼠板上消毒頸前皮膚后在距胸骨約1cm處縱行切開頸正中皮膚，鈍性分離淺筋膜及肌肉，至能清楚看見氣管環(huán)。③將已抽取含博萊霉素5mg·kg-1·d-1，0.2mL或相應(yīng)體積生理鹽水的1mL注射器(前帶7號針頭)經(jīng)兩氣管軟骨環(huán)間隙朝向心端刺入氣管，將大鼠直立，繼續(xù)進(jìn)針約1cm，回抽無阻力，抽回空氣，注藥，在不影響劑量準(zhǔn)確的前提下允許注射器中存有約0.5mL的空氣以確保藥物完全進(jìn)入氣道。④迅速將動物繞身體長軸左右旋轉(zhuǎn)30s，使藥物分布均勻。⑤縫合頸部皮膚。局部酒精消毒后放回籠中正常飼養(yǎng)。

腹腔給藥操作方法：常規(guī)腹腔注射操作。

2.3觀察指標(biāo)每天觀察動物的外貌特征，每天晚上測量大鼠體質(zhì)量，記錄體質(zhì)量變化情況。28d后腹主動脈放血處死，觀察肺臟外觀，左肺浸泡在體積分?jǐn)?shù)為10%的福爾馬林溶液中固定后，用常規(guī)石蠟包埋切片，分別進(jìn)行HE、Masson染色；取大鼠右肺裝入凍存管用鋁箔紙包好，在液氮中凍存30～60min后，轉(zhuǎn)至-70 ℃冰箱中儲存，以備制作肺組織勻漿測定羥脯氨酸(HYP)含量。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料采用ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1動物一般狀況兩對照組動物均進(jìn)食正常，毛色光亮，活動自如；兩模型組動物則食欲不振，毛色晦暗，變黃變糙，活動減少，狀態(tài)變差，顯示出明顯的病態(tài)。3.2動物生存率比較兩對照組動物均無死亡，生存率為100%；Q組有2只死亡，生存率為66.7%；F組有1只死亡，生存率為83.3%，P<0.05。

3.3動物體質(zhì)量變化給予BLM造模后兩對照組體質(zhì)量平穩(wěn)增長，F(xiàn)組動物體質(zhì)量在1～7d內(nèi)下降，第8天起開始恢復(fù)；Q組動物體質(zhì)量在前15d內(nèi)持續(xù)下降，第16天起開始恢復(fù)。多次腹腔注射給藥組與一次氣管給藥組相比，大鼠體質(zhì)量減少的個體間差異小，恢復(fù)快。見圖1。

圖12種給藥方式小鼠體質(zhì)量變化

Fig.1Thechangeofrat′sweightinducedbydifferentmedicineadministrationway

3.4肺臟外觀情況2種給藥方法的對照組大鼠雙肺表面光滑，顏色粉嫩，質(zhì)地均勻，彈性好；模型組情況基本相同，沒有顯著差別，均可見到肺臟萎縮，表面凹凸不平，有大小不等的囊氣腔突出，切開后可見小如針尖、大如米粒的囊腔。組織彈性差，部分區(qū)域呈蒼白色，可見散在的出血點(diǎn)及黃白色灶。3.5病理切片檢查2種給藥方法對照組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無炎性細(xì)胞，肺泡和間隔內(nèi)均未見到膠原成分；模型組動物中央氣道和大血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤，其中以中性粒細(xì)胞為主，還可見到成纖維細(xì)胞增生，膠原基質(zhì)增多，肺泡間隔明顯增厚并伴隨細(xì)胞浸潤，且纖維組織增生及成纖維細(xì)胞灶較多，肺泡腔塌陷，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)典型的肺纖維化改變。不同的是氣管給藥組膠原纖維分布在氣管周圍，而腹腔給藥組膠原沉積則主要分布在胸膜和肺間質(zhì)。見圖2。

3.6組織勻漿HYP含量氣管給藥組含量1±0.09μg·mL-1和腹腔給藥組含量1.05±0.05μg·mL-1均顯著高于氣管對照組0.75±0.04μg·mL-1和腹腔對照組0.80±0.04μg·mL-1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩模型組含量相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2肺組織病理學(xué)變化(×200)

A.HE氣管對照組：肺泡結(jié)構(gòu)正常；B.Masson氣管對照組：肺泡結(jié)構(gòu)正常；C.HE氣管給藥組：肺組織結(jié)構(gòu)破壞，大量炎性細(xì)胞滲出；D.Masson氣管給藥組：藍(lán)色膠原分布在氣管周圍；E.HE腹腔對照組：肺泡結(jié)構(gòu)正常；F.Masson腹腔對照組：肺泡結(jié)構(gòu)正常；G.HE腹腔給藥組：肺泡腔塌陷，大量炎性細(xì)胞滲出；H.Masson腹腔給藥組：藍(lán)色膠原主要分布在肺間質(zhì)

Fig.2Pathologicalchangesinlungtissue(×200)

A.HEintratrachealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；B.Massonintratrachealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；C.HEintratrachealadministrationgroup:thepulmonaryarchitecturewasdestroyed，andthemassiveinfiltrationofinflammatorycellwasshown；D.Massonintratrachealadministrationgroup:collagenwaslocatednearthebronehia；E.HEintraperitonealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；F.Massonintraperitonealcontrolgroup:normalalveolarstructurewasshown；G.HEintraperitoneallyadministeredgroup:thepulmonaryarchitecturewasdestroyed，andthemassiveinfiltrationofinflammatorycellwasshown；H.Massonintraperitoneallyadministeredgroup:collagenwasevenlydistributedinpulmonaryinterstialspace

4　討論

BLM是用于治療多種腫瘤細(xì)胞毒性的藥物，使用早期會出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)及類似肺炎癥狀，后期可產(chǎn)生呈進(jìn)行性發(fā)展的嚴(yán)重肺間質(zhì)纖維化[15]。由于其導(dǎo)致的動物肺間質(zhì)纖維化與人類肺間質(zhì)纖維化病理過程相似，故用BLM復(fù)制肺纖維化動物模型被認(rèn)為最接近于人的(IPF)病理特征[13,16]。本實(shí)驗(yàn)選用日本化藥株式會社生產(chǎn)的BLM。國產(chǎn)的博萊霉素A5 (BLM-A5)又名平陽霉素，是從我國浙江省平陽縣土壤中的放線菌培養(yǎng)液中分離得到的抗腫瘤抗生素。經(jīng)研究與國外的BLM成分相近。二者比較，BLM是多組分的復(fù)合藥，主要成分為A2；平陽霉素則為單一的A5[17]。BLM與BLM-A5都是治療多種腫瘤的細(xì)胞毒藥物，具有導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的不良反應(yīng)，并常用于復(fù)制肺纖維化動物模型。但張曉曄等[18]研究表明：BLM可在肺間質(zhì)形成廣泛的纖維化；但BLM-A5僅引起輕微的肺組織損傷，無法形成明顯的間質(zhì)纖維化。

經(jīng)氣管給藥復(fù)制IPF模型的優(yōu)點(diǎn)是方便、經(jīng)濟(jì)、可靠。此方法雖然要經(jīng)過氣管滴注，但僅需1次給藥，與連續(xù)10d腹腔注射的造模方法相比操作方便。因造模藥物昂貴，經(jīng)氣管給藥所需藥量僅為經(jīng)腹腔給藥所需藥量的1/30，故經(jīng)氣管給藥是非常經(jīng)濟(jì)的。此方法的缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)動物有一定的損傷，操作技術(shù)要求高。肺臟的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了藥物在肺部很難分布均勻。實(shí)驗(yàn)中雖采用了給藥后直立旋轉(zhuǎn)動物的方法，但BLM在左右兩側(cè)的數(shù)個肺葉中仍無法分布均勻。由于BLM致肺纖維化具有劑量依賴性[19]，若進(jìn)入各肺葉的BLM劑量不同，則各肺葉的纖維化程度也會有較大差異。預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管給藥的個別大鼠在給藥后仍活潑好動、狀態(tài)良好，說明BLM只進(jìn)入了部分肺葉，尚有一些肺葉未發(fā)生纖維化，故動物的呼吸功能并未受到明顯影響，這也是影響該方法造模成功的主要原因。但只要操作標(biāo)準(zhǔn)，確保BLM完全進(jìn)入氣管，給藥后對動物進(jìn)行充分旋轉(zhuǎn)使藥物在兩肺分布均勻，就可最大限度避免缺陷、保證造模成功。另外，氣管內(nèi)注射BLM，需麻醉大鼠后手術(shù)剖開頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織使氣管暴露，存在感染及術(shù)中損傷造成大鼠死亡的危險，故操作中應(yīng)盡量縮短操作時間、避免組織損傷，以期提高造模成功率。

采用腹腔注射BLM復(fù)制大鼠IPF模型操作簡單、個體間差異小，給藥劑量容易掌握，可減輕因手術(shù)操作差異造成的纖維化程度的差異。操作中應(yīng)注意使大鼠處于頭低腳高位，以避免誤傷腹腔臟器。

2種給藥方法復(fù)制IPF相比較，腹腔注射BLM后，BLM經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肺臟，故病變主要分布于肺組織及胸膜下；氣管內(nèi)注射的BLM經(jīng)支氣管上皮吸收后，可在支氣管周圍形成局部的BLM高濃度區(qū)域；因此，可在支氣管周圍而非周邊肺組織形成明顯的纖維化改變。腹腔注射法與臨床IPF病理分布更為接近，但二者所引起肺間質(zhì)的病理改變并無明顯差別。氣管注射BLM以其操作簡便、成模周期短和節(jié)省造模用藥的明顯優(yōu)勢，成為世界公認(rèn)的大鼠IPF模型的制備方法。

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Comparative study of 2 kinds of methods to induce pulmonary fibrosis model in rats

YAN Li1，XIE Yanhua1，YANG Qian1，WANG Siwang1*,CUI Jiahui2,WU Rangxin2

(1.Department of Natural Medicine，School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China;2.The Fourth Militory Medical University，Xi′an 710032，China)

ObjectiveToexplorethesimilaritiesanddifferencesbetweentheintratrachealandintraperitonealinjectiontoprepareidiopathicpulmonaryfibrosis(IPF)ratmodel.Methods24maleSDrats240-260g，wererandomlydividedintointratrachealcontrolgroup(QCgroup)，intratrachealadministrationgroup(Qgroup)，intraperitonealcontrolgroup(FCgroup)andintraperitoneallyadministeredgroup(Fgroup)，n=6.Theyweretreatedwithasingleintratrachealinjectionofsaline0.2mLorbleomycin(BLM) 5mg·kg-1·d-1；intraperitonealinjectionofsaline0.2mLorBLM15mg·kg-1·d-1，for10daysconsecutively.Allratswerekilledat28days.Thesurvivalrate，weight，lungappearance，pathologicalchangesandlungtissuehydroxyprolinecontentofeachgroupwereobserved.ResultsQgroupsurvivalratewas66.7%；Fgroupsurvivalratewas83.3%.Therewasasignificantdifference(P<0.05)betweenthe2groups.TheweightoftheratsgivenBLMwaslostafterinjection，theweightofFgroupwaslessonedinthefirst7daysandstartedtorecoveronthe8thday；theweightofQgroupcontinuouslydeclinedinthefirst15daysandbegantorecoversincethe16thday.TherewasnosignificantdifferencebetweenQgroupandPgroupinlungappearance.Fibrosiswaswidelyandstablyformed,mainlyaroundthetracheainthegroupQ，however，thesamechangesweremainlyseenunderthepleuraandpulmonaryinterstialspaceintheratofgroupP.Lungtissuehydroxyprolineofthe2modelswassignificantlyhigherthancontrolgroups，thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05)；buttherewasnodifferencebetweenthe2models.ConclusionIntratrachealadministrationandintraperitonealadministrationshowednosignificantdifferenceforpulmonaryfibrosisinrats.

bleomycin；pulmonaryfibrosis；model

閆莉，女，碩士

王四旺，男，教授，博士生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.014

R965

A

1004-2407(2016)05-0485-05

2015-11-16)