苦豆子對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的損傷作用

彭曉明，霍仕霞，竇　勤，閆　明，阿不都熱依木·肉孜，高　莉

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830049)

?

·藥理·

苦豆子對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的損傷作用

彭曉明，霍仕霞，竇勤，閆明，阿不都熱依木·肉孜，高莉

(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所,新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830049)

目的 探討苦豆子對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響。方法將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組及苦豆子低、中、高劑量組。除正常組外，其余大鼠以80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉連續(xù)灌胃給藥30d。給藥完成后，利用Morris水迷宮、穿梭避暗測(cè)試儀和跳臺(tái)記錄儀測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，化學(xué)比色法測(cè)定大鼠腦組織中的AchE活性。結(jié)果與正常組相比，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子可使水迷宮實(shí)驗(yàn)中大鼠的潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01)；避暗實(shí)驗(yàn)中大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)；穿梭實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少，主動(dòng)回避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的下臺(tái)潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.01)。此外，苦豆子給藥組大鼠腦組織中AchE活性也明顯升高(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論120和160g·kg-1·d-1的苦豆子對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶具有損傷作用。

苦豆子；學(xué)習(xí)記憶；損傷

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)是豆科槐屬多年生草本藥用植物，維吾爾語(yǔ)名為布牙，藥用根、莖、全草及種子，主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、甘肅和青海等干旱荒漠地區(qū)?？喽棺铀幮匀?jí)干寒，味苦，具有生干生寒、清熱燥濕、止瀉止痢和消炎鎮(zhèn)痛等作用[1]。目前國(guó)內(nèi)以苦豆子為原料研制開發(fā)的制劑有克瀉靈片、婦炎栓、苦豆子總堿直腸栓、苦參素注射液、復(fù)方苦豆子口腔潰瘍復(fù)合膜、苦豆子油擦劑和苦豆子乳膏劑等[2-3]。研究表明，苦豆子總生物堿和單體生物堿對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用[4]。曹曉東[3]發(fā)現(xiàn)，苦豆子總堿可引起小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凝固性壞死。本實(shí)驗(yàn)利用不同濃度的苦豆子粉作用于健康大鼠，研究其對(duì)大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響，為苦豆子的臨床安全用藥提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器IVC獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(IVC-Ⅱ，蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)；跳臺(tái)記錄儀(YLS-3TB，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；分析天平(BS224S，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；避暗穿梭測(cè)試儀(YLS-17B，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(ZS-001，北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)。

1.2試藥苦豆子購(gòu)自于新疆本草堂中藥飲片有限公司，將藥材粉碎，過(guò)120目篩。羧甲基纖維素鈉為天津光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。

1.3動(dòng)物健康SD大鼠48只，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～220g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2方法

2.1動(dòng)物給藥全部大鼠在IVC盒中適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，稱取體質(zhì)量，隨機(jī)分成4組，即正常組及苦豆子粉低、中、高劑量組，每組12只。正常組大鼠灌胃40mL·kg-1·d-1質(zhì)量濃度為5g·L-1的CMCNa，給藥組分別給予80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉，連續(xù)給藥30d。

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)第26天，大鼠給藥2h后選取每組6只大鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮為一黑色圓形水池，直徑120cm，高60cm，水深40cm，水溫25±1 ℃，分為4個(gè)象限，其中一象限內(nèi)水面下1.5cm處設(shè)置1個(gè)直徑為20cm的平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)前在水中加入墨汁，避免動(dòng)物直接發(fā)現(xiàn)平臺(tái)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行和空間搜索兩部分：(1)定位航行實(shí)驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)行4d，每天訓(xùn)練4次。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為潛伏期(latency)。大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立5s。若入水后90s大鼠未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中拖上平臺(tái)，并停留15s，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺(tái)，從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，測(cè)其第1次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間(潛伏期)和穿越原平臺(tái)的次數(shù)(crossingtimes)。

2.3避暗實(shí)驗(yàn)第25天，給藥2h后選取每組6只大鼠進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)。將大鼠背對(duì)洞口放入明室，暗室內(nèi)電柵通電。大鼠天生喜暗怕明，其隨后會(huì)進(jìn)入暗室。但會(huì)受到暗室電擊而退出，因此而產(chǎn)生暗室有電的短暫記憶。避暗實(shí)驗(yàn)將記錄大鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間為潛伏期，以及300s內(nèi)進(jìn)入暗室遭受電擊的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24h后重復(fù)測(cè)定1次，作為記憶成績(jī)。

2.4穿梭實(shí)驗(yàn)第27天，給藥2h后選取每組6只大鼠進(jìn)行穿梭實(shí)驗(yàn)。大鼠放入一室適應(yīng)2min，實(shí)驗(yàn)測(cè)試開始后，蜂鳴聲和燈光信號(hào)持續(xù)10s，大鼠如果在10s內(nèi)穿過(guò)通道進(jìn)入二室，記為主動(dòng)回避反應(yīng)(activeavoidresponse，AV)1次，其所需時(shí)間稱為主動(dòng)回避潛伏期(activeavoidlatency，AVLAT)；大鼠如果在10s內(nèi)不進(jìn)入暗室，則受到持續(xù)10s的電擊，受到電擊進(jìn)入對(duì)側(cè)則記為被動(dòng)回避反應(yīng)(passiveescaperesponse，ESC)1次。以此循環(huán)20次，24h后重復(fù)測(cè)定。2.5跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)第29 天，大鼠給藥2h后選取每組6只進(jìn)行跳臺(tái)檢測(cè)。將大鼠放入跳臺(tái)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通以36V2mA的交流電。此時(shí)，大鼠為逃避遭受電擊而躍上安全平臺(tái)，開始計(jì)時(shí)并觀察5min內(nèi)受電擊的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績(jī)。同時(shí)記錄計(jì)時(shí)開始至大鼠走下平臺(tái)遭受電擊的時(shí)間，作為下臺(tái)潛伏期，潛伏期超過(guò)300s，則以300s計(jì)算。24h后測(cè)試其記憶能力：將訓(xùn)練過(guò)的大鼠穩(wěn)當(dāng)?shù)胤庞谔_(tái)上，通電并開始計(jì)時(shí)，記錄開始至大鼠走下平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期)，以及5min內(nèi)大鼠走下平臺(tái)遭受電擊的次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)[5]。

2.6大鼠腦組織中AchE活性的測(cè)定大鼠完成給藥和行為學(xué)檢測(cè)后，腹主動(dòng)脈取血、處死。然后在冰上剝離腦組織并稱定質(zhì)量，加入9倍的生理鹽水，勻漿，以3 500r·min-1離心10min，吸取上清液備用。利用南京建成生物工程研究所的AchE試劑盒和BCA試劑盒測(cè)定大鼠腦組織中的AchE活性，具體測(cè)定方法為：分別設(shè)置并標(biāo)記測(cè)定管、對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)管(3個(gè))和空白管(3個(gè))。在測(cè)定管中加入50μL的待測(cè)腦組織勻漿，標(biāo)準(zhǔn)管中加入50μL的1μmol·mL-1標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，空白管中加入50μL的雙蒸水，對(duì)照管不加。然后在所有管中加入500μL的底物緩沖液和500μL的顯色應(yīng)用液，混勻，37 ℃準(zhǔn)確反應(yīng)6min。反應(yīng)完成后，依次在所有管中加入30μL的抑制劑、100μL的透明劑和50μL的穩(wěn)定劑，同時(shí)在樣品對(duì)照管中加入50μL的待測(cè)腦組織勻漿?；靹颍覝胤胖?5min，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀412nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算大鼠腦組織中的AchE活性，腦組織AchE活力=(測(cè)定A值-對(duì)照A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×對(duì)照品濃度÷待測(cè)樣本蛋白濃度。

3　結(jié)果

3.1苦豆子對(duì)大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中的定位航行實(shí)驗(yàn)主要用于測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)能力，空間搜索實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)大鼠的空間記憶能力，見圖1。由圖1可知，正常組和80g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠在水迷宮中游泳軌跡大多為趨向式，而120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠游泳軌跡則為隨機(jī)式，見表1。由表1可知，隨著檢測(cè)時(shí)間的增加，各組大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(即潛伏期)逐漸縮短。與正常組相比，苦豆子各給藥組大鼠的潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少(P<0.05或P<0.01)。

表1苦豆子對(duì)大鼠在Morris水迷宮中尋臺(tái)潛伏期(s)及末次穿臺(tái)次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

圖1大鼠在Morris水迷宮中的游泳軌跡圖

A．正常組；B．80g·kg-1·d-1苦豆子；C．120g·kg-1·d-1苦豆子；D．160g·kg-1·d-1苦豆子

Fig.1TheswimmingtrackgraphsofratsinMorriswatermazeA．normalgroup；B．Sophora alopecuroidesL.(80g·kg-1·d-1)；C．Sophora alopecuroidesL.(120g·kg-1·d-1)；D．Sophora alopecuroidesL.(160g·kg-1·d-1)

3.2苦豆子對(duì)大鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響避暗實(shí)驗(yàn)是利用動(dòng)物怕明喜暗的生理特性來(lái)檢測(cè)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的方法。動(dòng)物在進(jìn)入暗室過(guò)程中的錯(cuò)誤次數(shù)和潛伏期可反映動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。與正常組比較，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)比正常組明顯增多(P<0.05或P<0.01)，進(jìn)入暗室的潛伏期也顯著縮短(P<0.05或P<0.01)。見表2。

3.3苦豆子對(duì)大鼠穿梭實(shí)驗(yàn)的影響穿梭實(shí)驗(yàn)是一種檢測(cè)聯(lián)想記憶的經(jīng)典方法，動(dòng)物從被動(dòng)逃避到主動(dòng)逃避的學(xué)習(xí)過(guò)程(即主動(dòng)逃避潛伏期)越短，表明其記憶能力越強(qiáng)。與正常組比較，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子給藥組大鼠主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少(P<0.05或P<0.01)，且主動(dòng)回避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表2苦豆子對(duì)大鼠在避暗測(cè)試儀中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3苦豆子對(duì)大鼠在穿梭測(cè)試儀中主動(dòng)回避、被動(dòng)回避次數(shù)及主動(dòng)回避潛伏期的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.4苦豆子對(duì)大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)價(jià)動(dòng)物被動(dòng)回避的學(xué)習(xí)記憶能力，被測(cè)動(dòng)物的下臺(tái)潛伏期縮短或錯(cuò)誤次數(shù)增加，均可直接反映其記憶能力是否受到損傷。與正常組比較，大鼠經(jīng)苦豆子給藥30d后，其下臺(tái)潛伏期明顯縮短(P<0.05或P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4苦豆子對(duì)大鼠在跳臺(tái)記錄儀中潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.5苦豆子對(duì)大鼠腦組織中AchE活性的影響AchE(乙酰膽堿酯酶)是神經(jīng)遞質(zhì)Ach(乙酰膽堿)的水解酶，其活力可間接反映Ach含量及膽堿能神經(jīng)功能的情況。與正常組相比，苦豆子各給藥組大鼠腦組織AchE活性均顯著提高(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5苦豆子對(duì)大鼠腦AchE活性的影響

注：與正常組比較*P<0.05，**P<0.01。

4　討論

苦豆子在我國(guó)尤其是西北地區(qū)產(chǎn)量大，分布極廣，資源豐富，是一種重要的植物資源?？喽棺踊瘜W(xué)成分主要以生物堿為主，其地上部分含生物堿6.1%～8.03%，種子約含生物堿8.11%[6]。目前，從苦豆子中已分離鑒定的生物堿主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐定堿和苦豆堿等20多種[7]。研究發(fā)現(xiàn)，苦豆子生物堿在抗腫瘤、抗菌、抗心律失常、抗乙肝和免疫等方面具有重要的藥理活性和應(yīng)用前景。但由于苦豆子全草有毒，人口服15粒以上種子即出現(xiàn)頭暈、嘔吐、煩躁和心悸等不適反應(yīng)，且苦豆子中的氧化槐定堿和氧化苦參堿均具有中樞抑制作用，因此苦豆子對(duì)機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的影響值得關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)與機(jī)體其它器官系統(tǒng)聯(lián)系廣泛，且反應(yīng)迅速，其與藥物接觸后，神經(jīng)系統(tǒng)受損的表現(xiàn)會(huì)較早出現(xiàn)，因此神經(jīng)毒性的評(píng)價(jià)對(duì)于藥物早期毒性發(fā)現(xiàn)、保障藥物安全應(yīng)用有著非常重要的意義[8]。神經(jīng)行為可以在整體、動(dòng)態(tài)和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的內(nèi)涵下，關(guān)注藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷評(píng)估與預(yù)測(cè)，并可以此為指征確定毒性藥物的閾劑量。

本實(shí)驗(yàn)利用80，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子粉連續(xù)30d灌胃大鼠，與正常組大鼠比較，水迷宮實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少；避暗實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增多，潛伏期顯著縮短；穿梭實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的主動(dòng)回避反應(yīng)次數(shù)顯著減少，主動(dòng)回避潛伏期明顯延長(zhǎng)；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)給藥組大鼠的下臺(tái)潛伏期明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加。此外，苦豆子給藥組大鼠腦組織中的AchE活性均顯著提高。乙酰膽堿(Ach)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。AchE是Ach的水解酶，其活力可間接反映Ach的含量及膽堿能神經(jīng)功能的情況。綜上所述，120和160g·kg-1·d-1的苦豆子對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶具有損傷作用，可能與提高AchE活性、加速Ach的降解有關(guān)。

[1]新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所.中華本草-維吾爾藥卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：212.

[2]楊巧麗，顧政一，黃華.中藥苦豆子的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志，2011，26(3)：232-236.

[3]曹曉東.苦豆子總堿的毒性及HPLC法測(cè)定綿羊血漿四種苦豆子堿的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[4]邱天堯，趙宏英.苦豆子類生物堿的藥理作用研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2007，20(5)：508-509.

[5]石富國(guó)，蘭洲，劉繼平，等.當(dāng)歸芍藥散二氯甲烷提取部位對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[J].西北藥學(xué)雜志，2012，27(2)：128-130.

[6]高紅英，李國(guó)玉，王航宇，等.新疆苦豆子種子中生物堿類化學(xué)成分的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，29(1)：75-78.

[7]李艷艷，馮俊濤，張興，等.苦豆子化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，14(2)：133-136.

[8]袁伯俊，廖明陽(yáng)，李波．藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：459.

The damage effect of Sophora alopecuroides L.on learning and memory of rats

PENG Xiaoming，HUO Shixia，DOU Qin，YAN Ming，Abduriyim ROZI，GAO Li*

(InstituteofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，PrescriptionLaboratoryofXinjiangTraditionalUyghurMedicine，Urumqi830049，China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofSophora alopecuroidesL.onlearningandmemoryofrats.Methods48SDratswererandomlyassignedintocontrolgroupandSophora alopecuroidesL.group.Exceptfornormalgroup，ratsweretreatedbydifferentconcentrations(80，120and160g·kg-1·d-1)ofSophora alopecuroidesL.for30days.ThelearningandmemoryofratsweredetectedbyMorriswatermaze，shuttlebox，stepthroughtestandstep-downtest，andtheactivityofAchEinbrainofratswasmeasuredbychemicalcolorimetry.ResultsComparedwithnormalgroup，120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.couldprolongthelatencyanddecreasethecrossingtimesofratsinMorriswatermaze(P<0.05orP<0.01)，anditalsodecreasedtherat’slatencyofenteringdarkcabinandthenumberofactiveavoidresponseinshuttleboxandstepthroughtest(P<0.05orP<0.01).Moreover，Sophora alopecuroidesL.couldincreaseerrortimesofratsinstep-downtest(P<0.01)andtheactivityofAchEinbrain(P<0.05orP<0.01).Conclusion120and160g·kg-1·d-1ofSophora alopecuroidesL.havesignificantlydamageeffectsonlearningandmemoryofrats.

Sophora alopecuroidesL.；learningandmemory；damage

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(編號(hào)：201491174);新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基金項(xiàng)目(編號(hào)：KY2015140)

彭曉明，男，碩士，副研究員

高莉，女，副研究員

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.011

R965

A

1004-2407(2016)05-0474-04

2015-12-10)