槐耳聯(lián)合順鉑體外誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2自噬的實驗研究

謝龍騰，邱國仕,蔣永生，翁家武，馬軍，柯婷婷

槐耳聯(lián)合順鉑體外誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2自噬的實驗研究

謝龍騰，邱國仕,蔣永生，翁家武，馬軍，柯婷婷

目的觀察槐耳聯(lián)合順鉑是否能誘導(dǎo)HepG2細胞自噬及探討其對自噬相關(guān)蛋白表達的影響。方法采用體外細胞培養(yǎng)方法，分別用槐耳浸膏、順鉑及槐耳浸膏聯(lián)合順鉑干預(yù)HepG2細胞。用MTT法檢測細胞活性；光學(xué)顯微鏡觀察HepG2細胞自噬的形態(tài)學(xué)改變；Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白P53、P-Akt、Akt表達的影響。結(jié)果光學(xué)顯微鏡下可觀察到藥物組細胞的形態(tài)改變；MTT實驗顯示槐耳及順鉑均可抑制HepG2細胞的生長，呈時間及濃度依賴性；各藥物組細胞P-Akt蛋白表達水平下降，Akt和P53表達升高。結(jié)論槐耳給藥可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路激活肝癌HepG2自噬。

肝腫瘤；HepG2；癌細胞細胞自噬；槐耳；順鉑

原發(fā)性肝癌，特別是肝細胞性肝癌（以下簡稱肝癌），是最常見的惡性腫瘤之一，絕大部分中晚期肝癌患者缺乏有效的治療措施；而且，對肝癌采取包括中藥在內(nèi)的綜合治療的療效明顯優(yōu)于單一化療藥物的治療?；倍俏覈匾乃幱每鼓[瘤真菌．其主要成分是槐耳多糖蛋白（PS-T），臨床研究表明槐耳對肝癌有獨特的療效[1]，對其機制研究較多的是誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。順鉑為臨床一線化療藥，因其單藥大劑量應(yīng)用可引起不可逆性腎功能損害及嚴重的胃腸道反應(yīng)，因此目前臨床主張聯(lián)合用藥[2]。自噬是指真核生物在一些應(yīng)激狀態(tài)下的一種細胞自我消化過程的一系列生化過程[3]。作為細胞程序性死亡的重要方式之一，越來越多的證據(jù)表明自噬在腫瘤細胞的生長和抗腫瘤藥物的療效上扮演著重要的角色[4]。本實驗以肝癌細胞HepG2為研究對象，旨在通過槐耳聯(lián)合順鉑激活肝癌細胞 HepG2的自噬作用及其對相關(guān)蛋白P53、P-Akt、Akt表達的影響，探討其對PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路的影響。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　資料與方法

1.1材料槐耳顆粒（江蘇啟東蓋天力藥物有限公司）；小牛血清（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，sigma公司）；RPMI-1640干粉（美國 Gibco公司）；P-AKT（Abcam公司）；AKT antibody（Abcam公司），P53單克隆抗體（Abcam公司）；HRP標記的羊抗兔IgG （Stanta Cruz公司）；-actin（Cell Signaling公司）。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱（HERAEUS）；酶標儀（美國Bio-Rad公司）；電泳槽（美國Bio-Rad公司）；CKX41型倒置顯微鏡（OLYMPUS）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.3細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心。細胞用含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)；以0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，按實驗所需細胞密度接種，所有實驗均在細胞對數(shù)生長期進行。

1.4MTT法測定

1.4.1不同濃度的槐耳及順鉑單獨作用對MGC803增殖的影響取對數(shù)生長期的肝癌HepG2細胞消化后，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200l含有4×103個細胞，培養(yǎng)24 h后，分別設(shè)槐耳組、順鉑組、空白對照組，每組6復(fù)孔。藥物組加不同濃度的槐耳使其終濃度分別為 2、 4、6、8 mg/ml；順鉑使其終濃度分別為10、20、30、40g/ml，空白對照組為不加藥物的培養(yǎng)基。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h和48h后棄上清液，期間在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變，并攝影。之后用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，然后每孔加MTT 20 l，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，吸棄培養(yǎng)基，每孔加 150l DMSO，置微量振蕩儀上振蕩10 min，于酶標儀490nm處測定其OD值，以正常組OD值為對照，計算各孔細胞抑制率（%）=（1－各孔OD值/正常組OD值均數(shù)）×100%。

1.4.2槐耳與順鉑聯(lián)合給藥不同時間對MGC803細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的HepG2細胞消化后，制成4×103個/ml細胞混懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200l，正常培養(yǎng)24 h后，加入槐耳（4 mg/ml）+順鉑（10 g/ml）分別干預(yù)24 h。分別設(shè)空白對照組、聯(lián)合給藥組（4 mg/ml槐耳+10 g/ml順鉑）。其余實驗步驟同步驟1.4.1。

1.5Western blot法檢測 MMP-2蛋白的表達將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞于6孔板中，培養(yǎng)過夜，待其貼壁后，分為3組，分別為空白組，槐耳組（4 mg/ml）和聯(lián)合給藥組即槐耳（4mg/ml）+順鉑（10g/ml）。24 h后提取各組細胞總蛋白，BCA法定量后，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，加入一抗(1∶500），4℃孵育過夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，滴加ECL液沖洗顯色檢測相應(yīng)蛋白條帶并拍照。同時以 -actin作為內(nèi)參照，比較確定P53，P-Akt和Akt的相對表達水平。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組比較采用檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)改變倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常細胞生長狀況良好，細胞胞體飽滿，隨著槐耳濃度的增加及作用時間延長細胞數(shù)逐漸減少，部分細胞變圓，胞體變小，部分細胞破裂；大半細胞出現(xiàn)碎裂、脫落并漂浮于培養(yǎng)基中，呈壞死狀。見封三彩圖1。

2.2不同濃度槐耳、順鉑對HepG2細胞的生長抑制作用槐耳、順鉑均可抑制HepG2細胞的增殖，且均呈時間、劑量依賴性，當(dāng)藥物干預(yù)48 h后，槐耳濃度達到8 mg/ml時，HepG2細胞存活率僅為21.9%.；順鉑達到40.0g/ml，存活率為25.1%，對HepG2細胞的抑制程度達到最大。 24 h、48 h槐耳組OD值與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（≥3.41，均＜0.05）。見表1～2。

2.3槐耳與順鉑聯(lián)合干預(yù)不同時間對MGC803細胞存活率的影響槐耳+順鉑組 24 hMGC803細胞存活率為52.2%，48 h存活率為40.5%；24 h、48 h槐耳組、順鉑組、槐耳+順鉑組OD值與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（≥3.43，均＜0.05）。見表3。

2.4槐耳對肝癌HepG2細胞中蛋白表達的影響經(jīng)槐耳處理的HepG2細胞，P53和Akt蛋白表達水平明顯高于正常對照組，P-Akt表達低于正常組，且聯(lián)合順鉑給藥后這種差異更大，見圖1。

3　討論

自噬是真核細胞所共有的一種通過降解細胞內(nèi)過多或異常物質(zhì)以維持其正常功能的一種高度保守的生物學(xué)行為，能為細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，緩解應(yīng)激壓力[5]。自噬作為細胞的一種適應(yīng)性應(yīng)答，對腫瘤具有雙重的作用。一方面，自噬可以通過維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，抑制癌基因的激活，防止腫瘤的發(fā)生[6]。另一方面，自噬通過再循環(huán)作用，為癌細胞的生存提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而維持癌細胞的存活[7]?；倍且环N藥用真菌，槐耳菌質(zhì)的提取物，主要的抗癌活性成分為槐耳多糖，具有扶正與抗癌的雙重功能，多項基礎(chǔ)試驗研究證明，該藥具有抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多種細胞因子、提高機體免疫力等作用。目前已用于臨床，治療肝癌、乳腺癌、肺癌及胃癌等均有獨特的療效[8-11]，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K）家族成員屬于原癌基因，是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)分子，參與調(diào)控細胞的增殖、分化與凋亡等一系列的生理過程，Akt是一種分子量約為57 kD的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K信號通路的主要下游效應(yīng)分子之一。在許多惡性腫瘤中，PI3K/Akt信號通路參與細胞生長、腫瘤形成及侵襲、腫瘤藥物療效等方面的調(diào)控[12]。如 -欖香烯作用于胃癌SGC-7901細胞[13]和肺癌NSCLCA549細胞[14]均可通過抑制此通路而促進相應(yīng)的細胞自噬。此外還有許多中藥成分均可激活細胞自噬通過抑制PI3K/Akt信號通路：槲皮素也對胃癌MNK28細胞[15]；白蘆藜醇對白血病TALL細胞[16]；麥冬皂苷B對肺癌H15/ H460細胞[17]等。

本研究發(fā)現(xiàn)，槐耳對肝癌HepG2細胞的增殖有顯著的抑制作用。通過MTT結(jié)果可發(fā)現(xiàn)槐耳在體外聯(lián)合順鉑與單獨使用槐耳或順鉑相比對 HepG2具有更強的抗腫瘤細胞增殖作用，顯微鏡下的實驗結(jié)果結(jié)果也證實槐耳聯(lián)合順鉑對細胞的抑制作用更強，因而聯(lián)合用藥組顯示出了更明顯的優(yōu)勢。在 Western Blotting的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，相對于空白實驗組，單用槐耳組和槐耳聯(lián)合順鉑組均可上調(diào)P53、T-Akt蛋白的表達量，下調(diào)PAkt蛋白的表達量；槐耳聯(lián)合順鉑給藥可以通過上調(diào)P53、T-Akt及下調(diào)P-Akt促進細胞自噬。說明槐耳聯(lián)合給藥可能是通過抑制 PI3K/Akt信號通路激活肝癌HepG2自噬。

表1　不同濃度槐耳作用不同時間對HepG2細胞存活率的影響（ =6）

表2　不同濃度順鉑作用不同時間對HepG2細胞存活率的影響（ =6）

表3　槐耳與順鉑聯(lián)合干預(yù)不同時間對MGC803細胞存活率的影響（ =6）

圖1　Western blot法檢測組別處理肝癌HepG2細胞24h后P53P-Akt和Akt蛋白的表達情況

綜上所述，而槐耳作為一種新型抗腫瘤藥物，可以激活肝癌細胞自噬，其途徑可能是抑制 PI3K/Akt信號通路。兩者聯(lián)合使用可增加抗腫瘤活性，這也為臨床治療惡性腫瘤提供新的策略。

致謝我院作為溫州醫(yī)科大學(xué)非直管附屬醫(yī)院，非常感謝溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院的各位老師在本論文的完成過程中給予的各種幫助，使本實驗可以在溫州醫(yī)科大學(xué)和浙江省生物技術(shù)工程制藥重點實驗室開展實驗。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.05.020

R735.7

A

1671-0800(2016)05-0601-03

2016-02-15

（本文編輯：姜曉慶）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃（2016KYB275），象山縣科技計劃項目（2015C6005）

315700浙江省象山，象山縣第一人民醫(yī)院

蔣永生,Email: xsyykjk@126.com