CD88在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

柯少迎，　蘇子劍，　葉曉楠，　翟軍偉，　張劍華，　劉小瑜，　王聰仁，　潘群雄

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論著

CD88在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響

柯少迎，蘇子劍，葉曉楠，翟軍偉，張劍華，劉小瑜，王聰仁，潘群雄

目的觀察CD88在胃癌組織中的表達(dá)水平，探索CD88的表達(dá)水平對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)和Western blot方法檢測CD88在癌及癌旁組織中mRNA和蛋白的表達(dá)水平。使用CD88特異性小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC7901, 然后采用劃痕及transwell方法檢測細(xì)胞侵襲能力改變。結(jié)果在胃癌組織中，CD88 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯比癌旁組織高，沉默CD88后，SGC7901的侵襲遷移能力明顯減弱。結(jié)論CD88在胃癌中表達(dá)增加，并可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，可為胃癌的靶向治療研究提供新的靶點(diǎn)。

胃癌；CD88表達(dá)；侵襲；免疫組化；小干擾RNA；腫瘤標(biāo)記物

最近有研究發(fā)現(xiàn)CD88在炎癥過程參與細(xì)胞和血管生成，通過影響微環(huán)境參與惡性腫瘤進(jìn)展過程。而關(guān)于CD88與胃癌細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)系目前還不清楚。本項(xiàng)目檢測胃癌組織中CD88的表達(dá)，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)敲減了胃癌細(xì)胞株SGC7901中CD88表達(dá)，觀察敲減前后胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力的改變，探討CD88在胃癌進(jìn)展中的作用及其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1一般資料胃癌SGC7901細(xì)胞株(福建醫(yī)科所惠贈(zèng))，ECL發(fā)光液、顯影液、RNA抽提試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(碧云天)，CD88 siRNA及control siRNA均購自上海吉?jiǎng)P公司。選擇2013年5月至2015年8月于泉州第一醫(yī)院住院手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的胃癌患者70例，其中男42例，女18例，平均年齡(61.3±11.1)歲?；颊咝g(shù)前均未接受過針對(duì)腫瘤的治療。每例均取癌組織及癌旁組織(距癌組織邊緣>2 cm )各1份(1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm)，標(biāo)本投入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得患者同意。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)將胃癌SGC7901細(xì)胞株于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5%CO2，37 ℃恒溫中孵育。用含0.02%乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。

1.3CD88基因的siRNA序列設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建CD88基因的siRNA靶序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司設(shè)計(jì)，在Genebank用BLAST比對(duì)非特異結(jié)合。DNA單鏈在退火緩沖液中經(jīng)94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入56 ℃退火，在體外形成DNA雙鏈。Hind Ⅲ和BamH I雙酶切pSilencerTM3.1-H1質(zhì)粒后，與siRNA雙鏈DNA連接、轉(zhuǎn)化DH5et感受態(tài)細(xì)胞。挑菌測序。

1.4CD88基因沉默胃癌細(xì)胞模型建立按試劑盒提取純化pSilencer.CD88和pSilencer質(zhì)粒，與上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)公司提供的無關(guān)序列siRNA(control siRNA)定量后按照LipofectAMINE 2000的說明書轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后按1×105個(gè)細(xì)胞接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，于24、48、72 h時(shí)間段收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western印跡法檢測其CD88的表達(dá)狀況，驗(yàn)證沉默效率。

1.5Western blot檢測胃癌及癌旁組織中CD88的表達(dá)臨床胃癌及癌旁組織經(jīng)組織裂解液裂解，取樣品處理液進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉1 h。洗膜后加入鼠抗人CD88單克隆抗體(1∶800，Abcam)4 ℃孵育過夜。洗膜后加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG聚合物(1 ∶5 000，Abcam)室溫孵育1 h。洗膜后加入ECL，顯影、洗片、晾干。用凝膠圖像分析儀掃描照片，并采用灰度分析軟件計(jì)算各蛋白條帶的灰度值。

1.6RT-PCR檢測胃癌及癌旁組織中CD88的表達(dá) 試劑盒提取胃癌及癌旁組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Genebank中查找各基因序列，Primer5.0設(shè)計(jì)CD88引物序列。CD88上游引物序列為：5′-CCCTCAATGTCTAACCAA-3′，下游引物為5′-GAGTGTAGCGTGAATAGC-3′。PCR反應(yīng)體系為：10×Taq Buffer5 μl, 10 mM dNTP Mix 4.0 μl, 10 μM上下游引物各2 μl, 模板4 μl, 5 U/μl Taq 0.5 μl, ddH2O 32.5 μl, 共50 μl。PCR產(chǎn)物在1.3%瓊脂糖凝膠中，4 V/cm電泳40 min后，凝膠成像系統(tǒng)拍照并采用灰度分析計(jì)算產(chǎn)物條帶灰度值。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR檢測胃癌及癌旁組織中CD88 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，內(nèi)參基因actin擴(kuò)增產(chǎn)物在所有組織中均有穩(wěn)定表達(dá)(圖1A)。Real-time PCR結(jié)果顯示胃癌組織CD88的mRNA水平(1.03±0.13)明顯高于癌旁組織(0.62±0.05)(圖1A,1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　A：CD88 mRNA的RT-PCR電泳；

2.2Western blot檢測胃癌組織和癌旁組織CD88蛋白表達(dá)5對(duì)癌及癌旁組織內(nèi)參基因actin擴(kuò)增產(chǎn)物在所有組織中均有穩(wěn)定表達(dá)(圖2)。Western blot結(jié)果顯示胃癌組織CD88蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。

圖2　Western blot檢測癌和癌旁組織中CD88蛋白表達(dá)水平(T：癌組織；N：癌旁組織)

2.3CD88-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)SGC7901細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響CD88-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，細(xì)胞遷移能力[(19.2±2.0)個(gè)]明顯弱于對(duì)照組[(50.32±4.32)個(gè)](圖3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。沉默CD88后，SGC7901的侵襲能力也明顯降低(圖4)。

圖3　劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(光鏡，×20)。顯示沉默CD88后癌細(xì)胞的遷移能力明顯降低。

圖4　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(光鏡，×20)。顯示沉默CD88后癌細(xì)胞的侵襲能力明顯降低。

3　討論

有證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)可能起著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[1]或者抑制腫瘤進(jìn)展[2]的作用，補(bǔ)體系統(tǒng)C5a及其配體CD88在多種炎癥過程中起著重要的作用，然而，有關(guān)CD88與腫瘤的作用的研究尚少。

對(duì)于CD88在腫瘤中的表達(dá)，研究證實(shí)在肝細(xì)胞癌中CD88在腫瘤細(xì)胞中呈功能性表達(dá)[3]。在結(jié)腸腺癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌和前列腺癌中，與正常組織相比，CD88在癌細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，并在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)有腫瘤血管浸潤者的CD88明顯呈強(qiáng)陽性表達(dá)[4-5]。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)在15例犬乳腺癌動(dòng)物模型中檢測到CD88 mRNA表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD88的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)，包括浸潤性導(dǎo)管癌和浸潤性小葉癌；在乳腺纖維腺瘤中觀察到CD88弱表達(dá)，而在犬正常乳腺組織中未表達(dá)[6]。在非小細(xì)胞肺癌上同樣觀察到CD88在癌細(xì)胞上高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CD88表達(dá)可促進(jìn)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系的能動(dòng)性、侵襲能力和細(xì)胞骨架的改變[4]。我們應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測胃癌及癌旁組織中CD88 mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織表達(dá)明顯比癌旁組織高，應(yīng)用CD88-siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染CD88-siRNA的細(xì)胞遷移能力明顯減弱，從而表明CD88過表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，而抑制CD88表達(dá)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力可能降低。由此提示在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中CD88可能起重要作用。

對(duì)于CD88促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，目前尚不清楚。有學(xué)者觀察到表達(dá)CD88前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力能被C5a激活，并被基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抑制[8]。CD88表達(dá)可促進(jìn)人黏液表皮樣癌基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌從而增強(qiáng)侵襲能力[6]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD88可能通過影響T細(xì)胞而影響腫瘤免疫[6]。細(xì)胞內(nèi)CD88參與調(diào)控T細(xì)胞的活化和分化[9]。在小鼠乳腺癌動(dòng)物模型上觀察到CD88過表達(dá)，通過促進(jìn)抗腫瘤免疫而抑制小鼠乳腺癌的生長[10]。相反，在小鼠宮頸癌動(dòng)物模型中觀察到通過藥物阻斷CD88-C5a相互作用，可募集髓源性抑制細(xì)胞進(jìn)入腫瘤，放大T細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤免疫逃避和生長[5]。

綜上所述，炎癥反應(yīng)與腫瘤關(guān)系密切，特別是補(bǔ)體系統(tǒng)。對(duì)CD88的研究將不僅有助于人們更了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，還能促進(jìn)新的抗癌藥物和治療方法的開發(fā)和出現(xiàn)。

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Expression of CD88 and its effect on invasiveness of gastric carcinoma

KEShaoying1,SUZijian1,YEXiaonan1,ZHAIJunwei2,ZHANGJianhua1,LIUXiaoyu1,WANGCongren1,PANQunxiong1.

(1.DepartmentofOncologySurgery,AffiliatedQuanzhouFirstHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,China；2.DepartmentofSurgery,TengzhouCentralPeople’sHospital，Tengzhou277500，China)

PANQunxiong,E-mail：panqunxiong@126.com

ObjectiveTo study the expression level of CD88 in gastric cancer and normal tissue. To investigate the affection and mechanism of CD88 on migration and invasion activity of gastric cancer cell.MethodsThe different expression of CD88 protein levels in gastric carcinoma tissues and peritumoral tissues were determined by RT-PCR and Western blot respectively． After transfected with CD88 specific small interfering RNA(CD88-siRNA), the ability of migration and invasion of SGC7901 were examined by wound scratching and transwell assay.ResultsThe CD88 mRNA expression was significantly higher in gastric carcinoma tissues than that in the peritumoral tissues. CD88-siRNA can obviously inhibit cell activity of invasion and migration of SGC7901.ConclusionsThe expression levels of CD88 was increased and significantly enhanced the ability of invasion and migration in gastric cancer cell. This study provide new target for the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer;CD88;Invasion;Immunohistochemistry；siRNA；Tumor marker

福建省自然科學(xué)基金(2014J01435)； 泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013Z58)

362000福建泉州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院腫瘤外科(柯少迎，蘇子劍，葉曉楠，張劍華，劉小瑜，王聰仁，潘群雄)； 277500山東滕州，滕州市中心人民醫(yī)院外科(翟軍偉)

柯少迎，男，住院醫(yī)師，研究方向：腫瘤外科，E-mail： 44633091@qq.com

潘群雄，男，本科，主任醫(yī)師，教授，主要從事腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究，E-mail：panqunxiong@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.03.007

1674-4136(2016)03-0169-04

2016-01-09][本文編輯：李筱蕾]