微生物四項檢測儀與多管法的對比及應用

高心崗　張　芳

(青島佳明測控科技股份有限公司，青島 266000)

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微生物四項檢測儀與多管法的對比及應用

高心崗張芳

(青島佳明測控科技股份有限公司，青島 266000)

微生物四項檢測儀是基于國標方法酶-底物法研制的，可以同時檢測水體中菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌四項指標的快速檢測設備。本研究采用該微生物四項檢測儀，用標準菌液對儀器本身性能進行了驗證，并采用多點采集的飲用水及水源水水樣進行了微生物四項指標的測定，儀器檢測結果與國標傳統(tǒng)方法中的多管發(fā)酵法進行了對比。結果顯示該檢測儀的測定結果與多管發(fā)酵法具有較好的相關性，能滿足多種水樣實際檢測的要求，具有操作簡單、檢測周期短(大腸菌群 ≤12h、菌落總數(shù)≤18h)、靈敏度高、結果可靠等優(yōu)點，可用于對飲用水及水源水常規(guī)微生物四項指標的快速檢測及篩查，并起到預警作用。

水中微生物菌落總數(shù)檢測儀快速測定

生活飲用水的質量關系著千家萬戶人民的身體健康，隨著環(huán)境污染日益嚴重，關乎人們身體健康的飲水問題也變得越來越重要。生活飲用水的安全飲用微生物標準檢驗方法規(guī)定了菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌等四項常規(guī)檢測指標，并規(guī)定飲用水中菌落總數(shù)不得超過100CFU/mL；而當飲用水中總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌一旦檢出就意味著該飲用水已被污染，不得飲用。

目前，國內普遍采用《GB/T5750.12-2006 生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》來檢測生活飲用水中常規(guī)四項指標，其具有準確性好、可靠性高等特點，但是前期需要做大量的實驗準備工作，操作過程也較為繁瑣，需要較長時間才能獲得檢測結果，不適用于突發(fā)性公共衛(wèi)生應急事件和實時對飲用水、水源水進行全天候高頻率安全監(jiān)測。因此十分有必要研究適合水質常規(guī)四項微生物檢測指標快速檢測的方法。

微生物四項檢測儀是以國標方法里的酶-底物法為原理基礎研制的，可以同時檢測水體中菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌四項指標的快速檢測設備，具有操作簡單、檢測周期短(大腸菌群 ≤12h、菌落總數(shù)≤18h)、靈敏度高、結果可靠等優(yōu)點，有較高的實用價值。本研究采用該微生物四項檢測儀，用標準菌液對儀器本身性能進行了驗證，并采用多點采集的飲用水及水源水水樣進行了微生物四項指標的測定，儀器檢測結果與國標傳統(tǒng)方法中的多管發(fā)酵法進行了對比。結果顯示該檢測儀的測定結果與國標傳統(tǒng)方法多管發(fā)酵法具有較好的相關性，能滿足多種水樣實際檢測的要求，可用于對飲用水及水源水常規(guī)微生物四項指標的快速檢測及篩查，并起到一定的預警作用。

1　材料與方法

1.1樣品

實驗水樣品采自青島市白沙河、青島市嶗山水庫、本實驗室自來水。白沙河樣本與嶗山水庫樣本取自水面下30cm處，水體置于滅菌500mL玻璃廣口瓶中，封口、編號帶回實驗室。自來水樣本取自經(jīng)出水口滅菌的實驗室水龍頭，置于滅菌500mL玻璃廣口瓶中。

1.2試劑

乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC培養(yǎng)液等均購自青島高科園海博生物技術有限公司。

1.3菌種及菌懸液制備

大腸埃希氏菌(ATCC25922)購自中國藥品生物制品檢定所。

將37℃培養(yǎng)24h的大腸埃希氏菌斜面挑取適量菌體于無菌生理鹽水中，充分混合，并逐步稀釋至菌懸液濃度為107～108cfu/mL待用。

1.4儀器

多管發(fā)酵法：中試管、發(fā)酵管、500mL廣口瓶、玻璃培養(yǎng)皿、生物安全柜、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、載玻片、接種環(huán)和恒溫培養(yǎng)箱。

微生物四項檢測儀法：微生物四項檢測儀JMA-SZS-MP-1，由青島佳明測控科技股份有限公司提供。

1.5檢測方法

1.5.1多管發(fā)酵法(國標法)

多管發(fā)酵法參照HJ/T347-2007《水質糞大腸菌群的測定-多管發(fā)酵法和濾膜法》，具體步驟如下：

(1)初發(fā)酵實驗：

將原液作1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000稀釋。依次吸取1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000各1mL分別注入內裝有小發(fā)酵管和10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中，將已接種的發(fā)酵管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽性。如在倒管內產(chǎn)氣不明顯，可輕拍試管，有小氣泡升起的為陽性。

(2)復發(fā)酵試驗

輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)或滅菌棒將培養(yǎng)物轉接到EC培養(yǎng)液中。在44.5℃±0.5℃溫度下培養(yǎng)24h±2h。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣泡證實為糞大腸菌群陽性，按陽性管數(shù)查表。

1.5.2微生物快速監(jiān)測儀法(儀器法)

微生物四項檢測儀是基于酶-底物法為原理設計的，結合微生物、光、機、電、機械多領域技術研發(fā)而成，儀器使用一次性培養(yǎng)基，具有操作簡便，檢測速度快，準確性高等特點。測定步驟如下：把待測水樣100 mL加入測試指標對應的培養(yǎng)檢測瓶內，放入檢測儀指定槽位，按操作要求設置后開始自動檢測，視水樣濃度高低，幾個小時后結果自動在顯示屏幕上出現(xiàn)已測水樣結果。

1.5.2.1酶-底物法原理

待測微生物指標在最適溫度下培養(yǎng)生長，產(chǎn)生特定的酶可水解培養(yǎng)基中不同的底物生成有色物質。本系統(tǒng)采用的培養(yǎng)基能夠與該種特定酶生成不同的有色化合物，通過進行連續(xù)的分光光度測定，依據(jù)待測水樣色度變化并與水中的待測指標成一定關系，建立相關數(shù)學模型即可得出待測微生物指標的濃度。

1.5.2.2一次性培養(yǎng)基

儀器通過連續(xù)光度檢測培養(yǎng)基，根據(jù)色度變化結合算法得出最終待測指標的結果。

1.6數(shù)據(jù)分析

待測指標檢測結果先轉換為常用對數(shù)，然后采用下式比較兩種方法之間的差異，以實際偏差小于±30%作為可接受的結果。

式中：A-多管發(fā)酵法測定結果；

B-儀器法測定結果。

將檢測結果轉換為常用對數(shù)，輸入excel 2003，采用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2　結果

2.1微生物四項檢測儀實驗室參數(shù)驗證

2.1.1準確性驗證

制備總大腸菌群，耐熱大腸菌群，菌落總數(shù)標準品的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確計數(shù)的最高濃度。利用微生物四項檢測儀檢測其生長曲線，重復6次，如圖1所示。將標準菌懸液稀釋8個濃度梯度，用微生物四項儀檢測儀檢測其生長曲線如圖2所示。用微生物四項檢測儀檢測不同濃度菌群測得的標準曲線，如圖3所示。然后系列稀釋5個濃度梯度至較低濃度，每個濃度做3個平行。用多管發(fā)酵法與微生物四項檢測儀法平行檢測并計算加標回收率。結果如表1所示。從表1中可以看出微生物四項儀的加標回收率在83.33%～118.57%。同時從圖2可以看出，該方法能在12小時內檢測出低至100 CFU/mL的菌落總數(shù)及1 CFU/100mL的大腸菌群。

圖1　標準菌懸液生長濃度梯度生長曲線

圖2　8個梯度濃度的菌懸液生長曲線

圖3　不同濃度菌群測得的標準曲線圖

表1　微生物四項檢測儀檢測3種指標加標回收率　%

2.1.2精密性與重復性驗證

制備總大腸菌群，耐熱大腸菌群，菌落總數(shù)標準品的菌懸液，菌懸液的濃度應選擇為能夠準確讀數(shù)的最高濃度，然后系列稀釋5個濃度梯度至較低濃度。每一個濃度用微生物四項檢測儀進行10 次平行檢驗，對檢驗結果采用統(tǒng)計分析方法得到相對標準偏差。結果如表2所示，標準偏差在10.95%～27.19%之間。

表2　3個水樣檢測標準偏差　%

2.2微生物四項檢測儀對3種水樣檢測結果

分別以國標法和四項微生物檢測儀法對3個水樣的4種微生物指標進行檢測并計算準確度，白沙河水樣檢測結果如表3所示，嶗山水庫水樣如表4所示，自來水水樣如表5所示。

表3　白沙河水樣檢測結果　%

表4　嶗山水庫水樣檢測結果　%

續(xù)表4

表5　自來水水樣檢測結果　%

3　討論

本研究使用的微生物四項檢測儀，采用酶底物法的原理，在一個儀器上實現(xiàn)了菌落總數(shù)，總大腸菌群，耐熱大腸菌群和大腸桿菌埃希氏菌四項常規(guī)的微生物指標的同時檢測，對于快速檢測水質微生物污染提供了一種新的技術手段。但其具體的檢測性能還沒有相關的研究。

本研究首先制備了標準濃度的大腸埃希氏菌懸液來驗證微生物四項檢測儀的性能，從圖2和圖3結果可以看出，儀器測試得到的菌種生長曲線符合標準的生長曲線特點。進一步的測試顯示四項檢測儀的加標回收率在83.33%～117.39%。等效方法的檢驗結果均大于國標方法的70%。從精密性與重復性驗證結果可知標準偏差在10.95%～27.19%之間，均小于35%。說明微生物四項檢測儀用于水質微生物檢測結果可靠，具有可行性。且同傳統(tǒng)的國標法相比較，具有檢測時間短,小于12小時，操作更為簡便，無需確認實驗，自動化程度高的優(yōu)點。

用微生物四項檢測儀對3個不同來源的實際水樣進行了檢測，其檢測結果與國標法對比發(fā)現(xiàn)，準確度在-17.1%～36.5%之間，說明微生物四項檢測儀具有很好的實用價值。由于其檢測時間顯著短于多管發(fā)酵法，該儀器可用于及時有效的發(fā)現(xiàn)突發(fā)性水污染事件，從而有效防止突發(fā)性公共衛(wèi)生事件。

雖然在今后一段時間內，傳統(tǒng)方法與新技術將并存的局面還難于改變，但隨著科技進步，自動化檢測方法將是環(huán)境監(jiān)測工作的發(fā)展方向。精確、快速、可靠的檢測儀器將會得到應用與普及。

[1]GB7959-1987.糞便無害化衛(wèi)生標準[S].

[2]闞方琦,馬樂好,王方木,薛彥明.檢測食(飲)品大腸菌群紙片法與發(fā)酵法的對比試驗結果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007,17(7):1300-1301.

[3]唐漪靈,郭奕芳,吳翊,沈蕾.Petrifilm紙片法和國標法檢測奶制品細菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)的結果比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2000,10(3):325-327.

[4]國家藥典委員會.《中國藥典》(2010版).北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

Comparison and application of microbial four-parameter detector and multi tube method.

Gao Xingang,Zhang Fang

(Qingdao Jiaming Measurement and Control Tech.Co.Ltd.,Qingdao 266000,China)

The compared results showed that the detector had a good correlation with the multiple tubes fermentation method.The determination was rapid (total coliforms ≤12h and total bacteria ≤18h).It can replace the tubes fermentation method to detect the four microbial indicators in water.

microorganisms in the water;total bacteria;detector;rapid determination

項目：國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2013YQ060721)

高心崗，男，1968年出生，本科，高級工程師，長年從事環(huán)保在線監(jiān)測儀器開發(fā)工作，Email：13006525021@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.04.014

2015-12-23