連作對棉花抗枯萎病生理生化特性的影響

張亞楠，王興祥,3，李孝剛,*，徐文華

1 中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京土壤研究所，南京　210008　　2 江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，鹽城　224002　　3 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室，中國科學院紅壤生態(tài)實驗站，鷹潭　335211

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連作對棉花抗枯萎病生理生化特性的影響

張亞楠1，王興祥1,3，李孝剛1,*，徐文華2

1 中國科學院土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京土壤研究所，南京2100082 江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所，鹽城2240023 江西省紅壤生態(tài)研究重點實驗室，中國科學院紅壤生態(tài)實驗站，鷹潭335211

連作障礙引起棉花的產量和品質下降，嚴重制約著我國棉花產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展?？菸∽鳛榈湫偷耐羵髡婢『Γ恢笔抢_我國棉花生產的兩大病害之一。研究采用室內盆栽試驗，通過接種棉花枯萎病菌，研究不同連作年限(0、5、15a)土壤對棉花生長狀況及體內超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量的影響，進而探討其對棉花抗枯萎病性能的影響。研究結果表明：與非連作土壤相比，連作土壤顯著影響棉花的生長，導致棉花幼苗鮮重、主根長、株高降低，SOD和CAT活性降低，可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量升高，抗病品種中棉38的POD活性無顯著變化，但耐病品種南農10號的POD活性明顯提高。說明連作降低了棉花對枯萎病菌的抗氧化酶反應，加重了棉花的膜質過氧化程度，進而降低了棉花對枯萎病的抗性。

連作；棉花；枯萎病菌；抗氧化酶；抗病性

棉花(GossypiumhirsutumL.)是我國重要的經濟作物和紡織原料。由于耕地資源日益緊張，以及棉產區(qū)產業(yè)化發(fā)展的需求，原有輪作倒茬種植方式難以為繼，導致棉花連作日益嚴重，部分植棉區(qū)連作面積達到60%—70%，最長連作年限達30a。隨著連作年限的延長，棉花出現了大量死苗、生長不良、病蟲害頻發(fā)、早衰嚴重等問題，嚴重影響了棉花產量和品質，已成為我國棉花生產的一大制約因素[1]。枯萎病為棉花生產中的世界性病害，是由尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)引起的維管束病害，靠土壤傳播，防治難度較大，一旦發(fā)生，輕者致使棉花產量下降、纖維品質變劣，重者可造成絕產，一直是困擾我國棉花生產的難題[2]。目前在連作對土壤理化性質、土壤酶活和土壤微生物的影響等方面已有大量研究[3-5]，但連作后棉花對枯萎病抗性的變化鮮有報道。

到2013年，我國有750萬農戶種植420萬hm2的Bt抗蟲棉，種植面積已達棉花種植總面積的90%，平均每戶農民種植0.5hm2的Bt棉花[6]。由于抗蟲棉的大面積推廣應用，棉鈴蟲的危害得到了有效控制, 但是抗蟲棉育種重視了抗蟲與抗黃(萎病)，忽略了抗枯(萎病)的培育[7]。特別是在長年連作棉區(qū)，棉花枯萎病菌逐年積累，危害逐顯突出。由于抗蟲基因的導入, 導致一些生育性狀的改變[8]，造成轉基因抗蟲棉的抗病性較常規(guī)棉差，可能是引起連作棉花抗病性下降的重要因素之一[9-10]。另外，長期連作引起棉田土壤某些物理、化學性質的惡化、微生物群落失衡，進而可以引起植物體內活性氧(ROS)水平升高積累過多，影響超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性[11]。SOD、POD和CAT作為細胞膜系統(tǒng)的保護酶，可在逆境脅迫時，參與活性氧清除及酚類、木質素和植保素等抗病相關物質的合成，能抵御體內ROS及氧自由基對細胞膜系統(tǒng)的傷害，增強植物對病害的抵抗能力，是植物忍耐外界不良環(huán)境的機理之一[12-13]。因此，土壤環(huán)境的改變勢必會引起棉花抗病性能的變化。許多學者對多種植物感病后上述各種酶活性的變化規(guī)律進行研究，發(fā)現其活性與植物抗病性有密切關系[12,14]。

因此，本文通過研究不同連作年限條件下棉花生長及其抗氧化酶活性和膜質過氧化產物對枯萎病菌侵染的響應差異，以期從棉花對枯萎病菌的生理生化響應的角度探討連作棉花發(fā)病率上升的問題，從而為解決棉花連作問題提供新的理論依據。

1　材料與方法

1.1試驗材料與設計

試驗用土壤采自江蘇省鹽城市步鳳鎮(zhèn)鹽城沿海地區(qū)農科所農場(33°37′N, 120°37′E)。選取連續(xù)種植棉花5a(L5)和15a(L15)的棉田，于2014年4月多點采集表層土(0—20cm)，并采集棉田周邊近5a未種棉花的農田土壤(玉米/大豆-大麥輪作)作為對照(CK)。土樣采集后，立即帶回實驗室，去除動植物殘體、石塊后，過2mm篩，用于盆栽試驗。采用平板培養(yǎng)法測定CK、L5和L15土壤中枯萎病菌的數量，分別為0.4×103、2×103、11×103cfu/g土。同時分取一部分土樣，測定土壤基本理化性質(表1)。

表1　不同連作年限土壤的理化性質

供試棉花品種：抗枯萎病品種中棉38(Z-38)和耐枯萎病品種南農10號(N-10)，均為江蘇棉區(qū)普遍種植的雜交轉基因抗蟲棉。棉花種子由江蘇沿海地區(qū)農業(yè)科學研究所提供。

本研究使用的棉花枯萎病菌廣泛分布于長江和黃河流域棉區(qū)，屬于棉花枯萎病7號生理小種，由中國農業(yè)科學院棉花研究所提供。菌種經PDA培養(yǎng)基活化(30℃)5d后，孢子轉入PDA液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)48h(30℃，180r/min)，4層無菌紗布過濾，無菌水稀釋，使孢子液濃度達到約1.0×107cfu/mL。

試驗于室內人工氣候培養(yǎng)箱內進行。將不同連作年限的土壤分裝在盆缽中，每盆400g。挑選飽滿一致的棉花種子，50%的酒精浸泡5min，無菌蒸餾水沖洗5次，每盆播2粒，置于人工氣候箱內培養(yǎng)，光照14h(30℃)、黑暗10h(25℃)，濕度60%—90%，每天及時澆水。待子葉長出后定苗，每盆定植1株。棉花生長至三葉期時，用無菌刀片劃切傷根并接種棉花枯萎病菌孢子懸液5mL，補充水分保持濕度。兩個棉花品種分別設置3個不同土壤處理：連作5a土壤(L5)、連作15a土壤(L15)以及非連作土壤(CK)，每個處理3次重復，每個重復5盆，共90盆。

1.2測定指標與方法

1.2.1棉花樣品采集

分別在接菌前(0d)以及接菌后第2天、6天和第10天采集棉花植株樣品，采樣時每個處理隨機選3株，將棉花幼苗連帶土壤從盆子小心取出，浸入水中5—10min，流水將根部土壤小心沖洗干凈，盡量不損壞根部，無菌雙蒸水沖洗2—3次，置于-80℃冰箱保存，用于測定生理生化指標。并測定第10天采集的棉花樣品的株高、主根長、地上鮮重和根系鮮重。

1.2.2棉花生理生化指標測定

稱取0.5g葉片，置于預冷的研缽中，加預冷的4.5mL磷酸鹽緩沖液(0.1mol/mL，pH7.2)，在冰浴條件下研磨制備成10%的勻漿，3500r/min離心10min后，取上清液待測?？扇苄缘鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍法[15]，超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用黃嘌呤氧化酶法[16]，過氧化氫酶(CAT)活性測定采用可見光分光光度法[17]，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15]，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[18]。

1.3數據分析

采用Microsoft Excel軟件處理數據，用SPSS 16.0軟件進行方差分析和LSD多重比較法進行統(tǒng)計分析(P<0.05)。

2　結果與分析

2.1連作土壤對棉花幼苗生長的影響

由圖1可知，與對照非連作土壤相比，棉花枯萎病菌接種10d后，連作土壤中棉花長勢較差。長期連作土壤(L15)顯著降低了棉花地上鮮重，南農10號和中棉38地上鮮重分別比對照降低39.69%、26.91%。隨著連作年限的延長，根系鮮重呈下降趨勢。連作土壤也顯著抑制棉花主根的生長，種植在連作5a(L5)、15a(L15)土壤中的南農10號主根長分別比對照降低21.67%和28.33%，中棉38主根長分別比對照降低18.67%和16.33%。同時，連作土壤也顯著影響了棉花幼苗株高。

圖1　連作土壤對棉花幼苗生長的影響Fig.1　Effects of continuous cropping soils on the cotton seedling growth 不同字母表示處理間差異顯著(P<0. 05)

2.2連作土壤對棉花可溶性蛋白含量的影響

由圖2可以看出，病原菌接種前(第0天)，連作土壤中兩種棉花體內可溶性蛋白的含量較高，種植在連作5a(L5)和連作15a(L15)土壤中的中棉38可溶性蛋白濃度分別比對照高30.72%、91.27%，南農10號分別比對照高42.74%、35.48%。病原菌接種后，第2天到第6天，中棉38的可溶性蛋白含量總體隨連作年限增加而升高，種植在連作土壤(L5和L15)中的南農10號可溶性蛋白濃度顯著高于對照。第10天中棉38可溶性蛋白含量在連作土壤處理和對照之間無顯著差異。

圖2　連作土壤對棉花幼苗可溶性蛋白含量的影響Fig.2　Effects of continuous cropping soils on the content of soluble protein in cotton seedlings*表示連作土壤處理間與對照之間差異顯著(P<0.05)

圖3　連作土壤對棉花幼苗幼苗SOD活性的影響Fig.3　Effects of continuous cropping soils on the activities of SOD in cotton seedlings

2.3連作土壤對棉花抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，枯萎病菌接種前(第0天)，中棉38的SOD活性隨土壤連作年限的延長顯著升高，但是南農10號的SOD活性則隨著土壤連作年限延長顯著降低。接菌后第2天到第6天，兩個棉花品種的SOD活性均隨土壤連作年限的延長而降低，且不同連作年限土壤處理間均有顯著性差異。接菌后10d，南農10號SOD活性在各不同土壤處理間沒有顯著差異，而種植在L15土壤處理中棉38的SOD活性顯著高于L5和對照土壤處理。

不同連作土壤對兩種棉花體內CAT活性的影響與SOD活性一致。從病菌接種第0天到第2天，中棉38的CAT活性隨土壤連作年限延長而顯著升高，但南農10號的CAT活性則隨土壤連作年限延長而顯著降低(圖4)。病菌接種后第6天到第10天，南農10號CAT活性依然隨土壤連作年限的延長而降低，而中棉38的CAT活性呈現出隨土壤連作年限的延長而降低的趨勢。

圖4　連作對棉花幼苗CAT活性的影響Fig.4　Effects of continuous cropping soils on the activities of CAT in cotton seedlings

與非連作土壤相比，接菌前后，連作土壤對中棉38體內POD活性沒有顯著影響，但明顯增加了南農10號的POD活性(圖5)，其中在第0天、2天和10天有顯著差異。

圖5　連作對棉花幼苗POD活性的影響Fig.5　Effects of continuous cropping soils on the activities of POD in cotton seedlings

2.4連作土壤對棉花MDA含量的影響

由圖6可知，接菌前(第0天)，種植在連作土壤中的棉花體內MDA含量較高，并隨連作年限延長呈增加趨勢，說明連作土壤已經引起了棉花膜質過氧化反應。接菌后第2天到第10天，棉花體內MDA的含量升高，并隨連作年限增加而增加；與對照和連作5a土壤處理相比，長期連作土壤(L15)顯著增加了棉花體內的MDA含量(圖6)。

圖6　連作對棉花幼苗MDA含量的影響Fig.6　Effects of continuous cropping soils on the content of MDA in cotton seedlings

3　討論

已有許多研究表明，連作抑制棉花(GossypiumhirsutumL.)[19]、花生(ArachishypogaeaL.)[20]生長。郭紅偉等對連作辣椒(CapsicumannuumL.)的研究結果表明，連作土壤導致辣椒植株株高、莖粗和地上部鮮重下降[21]；王芳等發(fā)現連作茄子(SolanummelongenaL.)幼苗株高、葉面積、主根長和總根長明顯低于正茬[22]。也有研究表明，連作土壤滅菌后，蘋果幼苗的株高，鮮重和干重分別比不滅菌連作土的高83%、86%和91%[23]。本實驗結果表明，連作土壤中兩種棉花的主根長顯著減小、地上鮮重和株高顯著降低，根系鮮重也有不同程度降低。試驗期間棉花幼苗植株雖未出現明顯的發(fā)病癥狀，但連作土壤處理的棉花地下根系已出現發(fā)黑的現象，一級側根數目和根系鮮重明顯下降；而對照土壤接種棉花枯萎病菌后沒有類似現象出現。說明連作土壤首先對根部造成損害，影響了棉花生理生化代謝功能和正常生長，進而影響棉花的抗病能力。另外，棉花枯萎病菌是由棉花根部傷口侵入或根梢直接侵入，并由導管向上蔓延，引起整株棉花發(fā)病，因此連作土壤造成棉花根部的損傷可能引起棉花枯萎病發(fā)病率上升。

蛋白質是植物體生命過程中重要的結構物質和功能物質，其含量直接反映酶的含量，同時具有滲透調節(jié)的功能，影響植物的生理功能[24]。本研究結果表明，接菌前(第0天)，連作土壤中棉花體內的可溶性蛋白含量上升，說明連作后棉花能夠通過主動積累可溶性蛋白來降低細胞液的滲透勢，以防止細胞損傷。接菌后第2天到第10天，中棉38的可溶性蛋白含量隨連作年限增加而升高。雖然連作土壤引起南農10號可溶性蛋白含量升高，但連作15a土壤中的棉花可溶性蛋白含量顯著低于連作5a土壤處理。這種差異可能與不同棉花品種的抗病性有關：抗病品種中棉38種植在連作15a土壤中仍具有滲透調節(jié)能力，能夠積累蛋白調節(jié)滲透勢；而相比之下，耐病品種南農10號的調節(jié)能力則降低或失去，使細胞合成可溶性蛋白的能力降低。說明連作土壤嚴重影響了棉花體內的蛋白質代謝，長期連作(L15)條件下，病原菌的脅迫破壞了南農10號體內蛋白質的正常代謝功能，進而降低了棉花的抗病能力。

作物遭受病菌侵染后，感病品種體內的SOD活性水平顯著低于抗病品種[31-32]，即使是同種植物，感病時期的SOD活性比抗病時期的活性低[33]。向妙蓮[34]等研究了接種白葉枯病菌對不同抗性水稻的抗氧化酶的影響，結果表明抗病品種的SOD和CAT活性高于感病品種。接菌后第2天到第10天，病原菌侵染引起了兩種棉花的SOD和CAT活性隨連作年限延長而降低，說明連作后棉花的抗病性降低。然而，接菌后耐病品種南農10號POD活性則隨連作年限延長而升高，而抗病品種中棉38的POD活性各處理間無顯著變化，這可能與兩棉花品種對病原菌抗性差異有一定關系。病原菌接種后造成了種植在連作土壤中的耐病品種南農10號CAT活性顯著低于非連作土壤處理，引起其體內H2O2水平上升，導致過氧化物積累，進而可能誘導了體內POD酶活升高；而抗病品種中棉38體內相對較高的CAT活性能分解H2O2，可能沒有誘導POD活性升高。本研究表明，連作土壤顯著降低了棉花應對病原菌侵染引起的過氧化反應的能力，說明連作下棉花體內消除ROS的效率顯著降低，進而降低了棉花的抗病性。但是連作條件下不同棉花品種對枯萎病菌抗氧化反應存在差異，也為棉花引種和棉花輪作倒茬提供理論依據。

4　結論

綜上所述，長期連作土壤顯著影響了棉花正常生長，改變了棉花抗枯萎病菌生理生化特性，其中可溶性蛋白和MDA含量顯著升高，SOD和CAT活性顯著降低，兩種棉花的POD活性對枯萎病菌響應的差異，也反映了不同品種之間的抗病性能的差異。研究結果表明，長期連作對棉花的生長和生理生化代謝造成影響，進而降低了棉花的抗枯萎病性，這可能是連作條件下棉花發(fā)病上升的重要原因之一。但連作條件下不同棉花品種對枯萎病的生理生化響應存在差異，因此在棉花引種時重視抗蟲性的同時也應重視棉花的抗病性能，種植過程中應盡量避免非抗病品種連作。

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Effects of continuous cropping on physiological and biochemical resistance ofcotton toFusariumwilt

ZHANG Yanan1, WANG Xingxiang1,3, LI Xiaogang1,*, XU Wenhua2

1KeyLaboratoryofSoilEnvironmentandPollutionRemediation,InstituteofSoilScience,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,China2InstituteofAgriculturalSciencesintheCoastalAreaJiangsuProvince,Yancheng224002,China3JiangxiKeyLaboratoryofEcologicalResearchofRedSoil,ExperimentalStationofRedSoil,ChineseAcademyofSciences,Yingtan335211,China

Cotton is an economically important crop worldwide. In the primary cotton-producing regions of China, it is increasingly grown repeatedly on the same land, because of the development of effective methods for control of the cotton bollworm (Helicoverpaarmigera) using transgenic insect-resistant cotton varieties. However, consecutive cropping has resulted in continuous declines in yield and quality as a consequence of increasing disease pressure. CottonFusariumwilt, a vascular disease caused by soil-borneFusariumoxysporumf. sp.vasinfectum, is a major constraint on cotton production throughout the world. In this study, a pot experiment was conducted to investigate the physiological and biochemical resistance of cotton toF.oxysporumin different soils under continuous cropping, and to provide a scientific explanation for the increase in cotton disease incidence in continuous cropping schema. Two cotton cultivars (Z-38, N-10) with different levels of resistance toF.oxysporumwere used, and continuous-cropping soils were collected from two cotton fields that had been continuously cropped with cotton for 5 a and 15 a, respectively, with the soil from a field not previously used in cotton-cropping used as the control. The pot experiment was conducted in a plant growth chamber at 30 ℃/25 ℃, 14 h light/8 h dark, and 60%—90% relative humidity, with three repetitions. After culturing for 20 d, the pots were inoculated withF.oxysporumspores (1.0 × 107cfu/mL). Plant samples were collected prior to inoculation (day 0) and at 2 d, 6 d, and 10 d after inoculation. The cotton plants were separated into their root and shoot portions to measure the fresh root and shoot weight, root length, and plant height, and then rapidly frozen at -80 ℃ for use in biochemical analyses. The soluble protein and malondialdehyde (MDA) contents, and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) were measured in the cotton leaves. The results showed that continuous-cropping soils significantly inhibited the growth of cotton seedlings. The fresh shoot weights of the N-10 and Z-38 plants in the 15 y cropping soils were substantially reduced, by 39.69% and 26.91%, respectively, compared to the control. Root weights showed a decreasing trend with prolonged cropping time. The root lengths of the Z-38 and N-10 plants were 16.33% and 21.67% lower, respectively, in the 15 y cropping soils, than in the control. Furthermore, continuous-cropping soils significantly inhibited the vertical growth of the cotton plants. Compared to the control, continuous-cropping soils significantly increased the soluble protein content at 0 d, 2 d, and 6 d after inoculation. Prior to inoculation, SOD and CAT activities increased in the Z-38 plants, but decreased in the N-10 plants as the number of cropping years increased. After inoculation withF.oxysporum, the SOD and CAT activities in both cotton cultivars decreased as the number of cropping years increased. Continuous-cropping soils strongly enhanced the activity of POD in the N-10 plants at 0 d, 2 d, and 10 d ofF.oxysporumincubation, but had no effect on Z-38. Continuous-cropping soils significantly enhanced the MDA contents of both cultivars after inoculation withF.oxysporum. In summary, the continuous-cropping soils significantly affected the activities of the antioxidant enzymes of cotton cultivars, and increased the degree of lipid peroxidation, resulting in a decline in the resistance of cotton toF.oxysporum.

continuous cropping; cotton;Fusariumoxysporum; antioxidant enzymes; disease resistance

江蘇省自然科學基金青年項目(BK2012498)；國家自然科學基金項目(41201281, 41371290)

2014-12-05; 網絡出版日期:2015-10-26

Corresponding author.E-mail: xgli@issas.ac.cn

10.5846/stxb201412052416

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