突變型黃單胞桿菌產(chǎn)黃原膠條件的優(yōu)化

張超鳳，范麗君，李情敏，陳衛(wèi)平，張鳳英*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

突變型黃單胞桿菌產(chǎn)黃原膠條件的優(yōu)化

張超鳳，范麗君，李情敏，陳衛(wèi)平，張鳳英*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

該文對(duì)從甘藍(lán)腐爛根部的土壤中分離選育的黃單胞桿菌C2發(fā)酵產(chǎn)黃原膠的條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基（碳源、氮源及碳氮源的濃度）和發(fā)酵條件（接種量、發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH、裝液量）進(jìn)行優(yōu)化；為提高黃原膠的膠體性能，在培養(yǎng)中添加不同量的游離丙酮酸。結(jié)果表明，液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠的最佳碳源、氮源分別為蔗糖55 g/L，魚(yú)粉10 g/L。黃單胞桿菌C2菌株在接種量為4%，pH值為7，于28℃、130 r/m in條件下發(fā)酵60 h時(shí)，黃原膠產(chǎn)量達(dá)到34 g/kg。添加游離丙酮酸2 g/L時(shí)發(fā)酵液黏度為16.0 Pa·s，此時(shí)膠體性能最好。

黃單胞桿菌；黃原膠；發(fā)酵黏度

黃原膠（xanthan gum）是由黃單胞桿菌等產(chǎn)莢膜菌菌株發(fā)酵分泌的一種胞外酸性水溶性多糖［1］。因其具有良好的理化性質(zhì)［2］，自20世紀(jì)50年代后期發(fā)現(xiàn)以來(lái)，到60年代初就開(kāi)始進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)［3］。在1988年8月我國(guó)（原）衛(wèi)生部批準(zhǔn)了食品級(jí)黃原膠的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，并將其列入食品添加劑名單［4］。至今在食品［5］、化工［6］、化妝品、農(nóng)藥［7］等行業(yè)，黃原膠已被廣泛利用。特別是在食品行業(yè)中，黃原膠對(duì)干酪的質(zhì)構(gòu)［8］、淀粉的糊化［9］和肉制品的品質(zhì)［10］等方面有顯著的效果。但與國(guó)外相比，由于起步晚，國(guó)內(nèi)黃原膠的生產(chǎn)工藝技術(shù)還處于粗放型的初級(jí)階段，存在著生產(chǎn)消耗高、收率低、產(chǎn)品質(zhì)量差等諸多問(wèn)題。據(jù)2010年資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的黃原膠生產(chǎn)總量達(dá)到7.4萬(wàn)t，約占囯際生產(chǎn)總量的67%。然而，國(guó)內(nèi)廠家的產(chǎn)膠技術(shù)仍然沒(méi)有達(dá)到海外先進(jìn)水平，企業(yè)效益和競(jìng)爭(zhēng)力與國(guó)外相比，仍然比較低。

黃原膠的產(chǎn)量與菌株有關(guān)［12］，丙酮酸含量的不同會(huì)影響黃原膠的性質(zhì)［13］。另外，在發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)條件（如溫度、pH等）會(huì)影響黃原膠的性質(zhì)［14］。尤其在液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，由于pH的變化較大，產(chǎn)量也隨之變化較大［15］。

本實(shí)驗(yàn)利用從甘藍(lán)腐爛根部的土壤中分離選育的黃單胞桿菌（Xanthomonas campestris）C2發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠，通過(guò)改變培養(yǎng)基中的碳源、氮源，發(fā)酵條件及游離丙酮酸

添加量，以期提高黃原膠產(chǎn)量、改善膠體性能。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

黃單胞桿菌C2：從甘藍(lán)根部腐爛土壤中分離選育。1.1.2培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，牛肉浸膏3.0 g/L，pH7.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖50.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，MgSO4· 7H2O 0.3 g/L，CaCO33.0 g/L，K2HPO4·3H2O 5.0 g/L。

牛肉膏培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.2～7.4。

1.2儀器與設(shè)備

754型紫外光分光分度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；PHB-8型筆試pH計(jì)：上海醫(yī)用核子儀器廠；LDZX-40B型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HH-2型恒溫水浴鍋：國(guó)安電器有限公司；TGL-16C型臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SPH-111F標(biāo)準(zhǔn)型恒溫培養(yǎng)振蕩器搖床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1菌體培養(yǎng)過(guò)程中生物量變化

從斜面選取黃單胞桿菌C2于種子液培養(yǎng)基中對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)。裝液量為50 m L/250 m L，在30℃、130 r/min條件下培養(yǎng)72 h。每隔12 h取3個(gè)三角瓶進(jìn)行菌體生物量檢測(cè)，觀察其變化。

1.3.2培養(yǎng)基配方優(yōu)化

碳源及其濃度的確定：分別以50 g/L的米粉、葡萄糖、蔗糖作為碳源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，考察其對(duì)產(chǎn)黃原膠的影響；選取合適的碳源后分別調(diào)整碳源質(zhì)量濃度為35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L和60 g/L。裝液量為50 m L/250 m L，在30℃、130 r/m in條件下發(fā)酵培養(yǎng)60 h。每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行，測(cè)定其黃原膠產(chǎn)量［18］。

氮源及其濃度的確定：分別以5 g/L的魚(yú)粉、蛋白胨、豆餅粉、麩皮作為氮源替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，考察其對(duì)產(chǎn)黃原膠的影響；選取合適的氮源后分別調(diào)整氮源質(zhì)量濃度為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L和25 g/L。裝液量為50 m L/250 m L，在30℃、130 r/m in條件下發(fā)酵培養(yǎng)60 h。每個(gè)質(zhì)量濃度做3個(gè)平行，測(cè)定其黃原膠的產(chǎn)量。

1.3.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

以上述試驗(yàn)中確定的最佳培養(yǎng)基配方為發(fā)酵液，在30℃、130 r/min條件下培養(yǎng)60h。分別考察接種量（2%、4%、6%、8%、10%），發(fā)酵時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h），發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃），pH值（4、5、6、7、8、9、10），裝液量（50m L/250m L、100m L/250m L、125m L/250m L、150 m L/250 m L）對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響。

1.3.4游離丙酮酸對(duì)黃原膠膠體性能的影響

在上述確定的最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件的條件下，分別添加1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L游離丙酮酸，考察游離丙酮酸質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠膠體性能的影響。

1.3.5測(cè)定方法

生物量：采用干質(zhì)量法進(jìn)行測(cè)定。

黃原膠產(chǎn)量：采用酒精沉淀法測(cè)定。

發(fā)酵液黏度：采用2，4-二硝基苯肼比色法進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1菌體培養(yǎng)過(guò)程中生物量變化

搖瓶培養(yǎng)（30℃、130 r/m in）不同時(shí)間，測(cè)定菌體生物量，并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　菌體生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of strain C2

由圖1可知，黃單胞桿菌C2在12～36 h處于對(duì)數(shù)期，菌體迅速繁殖。36 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量穩(wěn)定。因此選定在發(fā)酵液中培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液作為種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2碳源對(duì)生產(chǎn)黃原膠的影響

2.2.1不同碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

選擇葡萄糖、蔗糖、米粉等常見(jiàn)且廉價(jià)的成分作為碳源，對(duì)其進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，研究碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量影響，結(jié)果如圖2。

圖2　碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of carbon sources on xanthan gum production

由圖2可知，以蔗糖為碳源時(shí)黃原膠產(chǎn)量最高，米粉次之，葡萄糖作為碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響并不是十分突出。可能是由于糖類(lèi)除了作為碳源外，還具有維持一定滲透壓的作用。由于葡萄糖為單糖，蔗糖為二糖，它們結(jié)構(gòu)上的不同有可能使其在溶液中的滲透壓出現(xiàn)一些差異。還有可能是因?yàn)樘墙?jīng)高溫高壓滅菌后，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值不同程度的降低，影響黃單胞桿菌的增殖，而蔗糖對(duì)pH的影響最小，利于保證黃單胞桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境。因此選擇蔗糖為合適的碳源。

2.2.2蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

在確定蔗糖為最佳碳源后，考察蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3。

圖3　蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠的產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of sucrose concentration on xanthan gum production

由圖3可知，黃原膠產(chǎn)量隨蔗糖質(zhì)量濃度的增加而升高，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為55 g/L時(shí)，黃原膠產(chǎn)量最高。蔗糖質(zhì)量濃度＞55 g/L以后，黃原膠產(chǎn)量基本不變。這可能是因?yàn)檎崽菨舛容^低時(shí)，對(duì)于黃單胞桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)黃原膠均不足；隨著碳源濃度的提高，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，黃原膠產(chǎn)量增加；當(dāng)蔗糖的質(zhì)量濃度為55～60 g/L時(shí)，細(xì)菌繁殖旺盛且穩(wěn)定，使得黃原膠產(chǎn)量也較高。因此選擇蔗糖的質(zhì)量濃度為55 g/L。

2.3氮源對(duì)生產(chǎn)黃原膠的影響

2.3.1氮源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

選取常見(jiàn)的玉米粉、蛋白胨、魚(yú)粉、豆餅粉、麩皮作為氮源，搖瓶發(fā)酵做對(duì)比試驗(yàn)，研究不同氮源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4。

圖4　氮源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources on xanthan gum production

由圖4可知，使用魚(yú)粉作為氮源時(shí)黃原膠產(chǎn)量最高，之后依次是豆餅粉、蛋白胨、玉米粉和麩皮。因此選擇魚(yú)粉作為合適的氮源。

2.3.2魚(yú)粉質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

由圖5可以看出，魚(yú)粉質(zhì)量濃度為10～25 g/L時(shí)，對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響不大。氮源主要是用于黃單胞桿菌菌體的生長(zhǎng)［19］，所以10 g/L的魚(yú)粉已足夠菌體的生長(zhǎng)并使得黃單胞桿菌C2大量合成黃原膠考慮到成本，魚(yú)粉質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)最經(jīng)濟(jì)、高效。因此選擇魚(yú)粉質(zhì)量濃度為10 g/L較為適宜。

圖5　魚(yú)粉質(zhì)量濃度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fish m eal concentration on xanthan gum production

2.4發(fā)酵條件對(duì)黃原膠產(chǎn)量及發(fā)酵液黏度的影響

2.4.1接種量對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

圖6　接種量對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of inoculum on xanthan gum production

由圖6可知，黃原膠產(chǎn)量隨接種量增加而增加，接種量為4%時(shí)黃原膠產(chǎn)量較高。接種量繼續(xù)增加，黃原膠產(chǎn)量基本不變，過(guò)多的接種并沒(méi)有多大的意義反而會(huì)造成浪費(fèi)。因此選擇合適的接種量為4%。

2.4.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

圖7　發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on xanthan gum production

由圖7可以看出，發(fā)酵12 h后，黃原膠產(chǎn)量開(kāi)始迅速增加，60 h時(shí)黃原膠產(chǎn)量達(dá)到最高，發(fā)酵60 h后，黃原膠產(chǎn)量有下降的趨勢(shì)。因此選擇60 h為合適的發(fā)酵時(shí)間。

2.4.3發(fā)酵溫度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

圖8　發(fā)酵溫度對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of fermentation tem perature on xanthan gum production

由圖8可知，黃單胞菌適宜生長(zhǎng)的溫度為28～32℃，在此范圍內(nèi)黃原膠產(chǎn)量較高且溫度對(duì)黃原膠的合成影響不是很大。發(fā)酵溫度為28℃時(shí)黃原膠產(chǎn)量最高。因此選擇28℃為合適的發(fā)酵溫度。

2.4.4pH值對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

圖9　pH值對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of pH on xanthan gum production

由圖9可知，發(fā)酵液的pH為4～7時(shí)，隨著pH的增加，黃原膠的產(chǎn)量增加；發(fā)酵液的pH為7～10時(shí)，隨著pH的增加，黃原膠的產(chǎn)量減少。雖然黃原膠具有一定的穩(wěn)定性，pH對(duì)黃原膠的性質(zhì)影響不大，但對(duì)菌體合成黃原膠還是有一定的影響。在溶液呈中性（即pH為7）時(shí)黃單胞桿菌的活性最高，黃原膠的產(chǎn)量也達(dá)到最高。因此選擇pH7為合適的發(fā)酵pH值。

2.4.5培養(yǎng)基裝液量對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

由圖10可知，隨著培養(yǎng)基裝液量的增加，黃原膠的產(chǎn)量在下降。因?yàn)榫w的代謝過(guò)程是有氧呼吸，隨著裝液量的增加，裝置內(nèi)的氧氣下降，菌體的活性也隨之降低，因而黃原膠的產(chǎn)量下降。由此選擇在250m L三角瓶中加入50m L發(fā)酵液為最佳裝液量。

圖10　培養(yǎng)基裝液量對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of the volum e o f medium on xanthan gum production

2.5游離丙酮酸的加入對(duì)黃原膠膠體性能的影響

由黃原膠生物合成的代謝工程可知，碳氮源合成黃原膠的代謝途徑與丙酮酸合成黃原膠的代謝途徑是不同的，即在初始發(fā)酵條件不變的情況下，游離丙酮酸的添加會(huì)影響黃原膠的膠體性能，發(fā)酵液黏度越高則膠體性能越好，而對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響較小。

圖11　游離丙酮酸對(duì)黃原膠膠體性能的影響Fig.11 Effect o f contents of free pyruva te on xanthan gum produc tion

由圖11可知，游離丙酮酸添加量為2 g/L時(shí)，發(fā)酵液黏度最高，為16.0 Pa·s，此時(shí)黃原膠膠體性能最好。當(dāng)游離丙酮酸添加量＞3 g/L，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的初始pH下降，發(fā)酵液黏度降低，從而影響黃原膠的膠體性能。因此選擇游離丙酮酸添加量為2 g/L。

3　結(jié)論

黃原膠是次生代謝產(chǎn)物，縮短菌種的生長(zhǎng)期和延長(zhǎng)的穩(wěn)定期可提高其產(chǎn)量。本試驗(yàn)繪制了黃單胞桿菌C2的生長(zhǎng)曲線，確定了對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期分別為12～36 h和36～72 h。通過(guò)改變了發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源及其濃度和發(fā)酵條件，以降低生長(zhǎng)期和延長(zhǎng)穩(wěn)定期，從而提高了黃原膠的產(chǎn)量。另外為提高黃原膠的膠體性能，向發(fā)酵液中添加一定量的游離丙酮酸。最終確定黃單胞桿菌C2產(chǎn)黃原膠的最適發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源分別為蔗糖55 g/L，魚(yú)粉10.0 g/L。菌株黃單胞桿菌C2發(fā)酵產(chǎn)黃原膠的最適條件為初始pH值為7，發(fā)酵溫度28℃，接種量為4%，裝液量50 m L/250 m L，發(fā)酵時(shí)間60 h，在此條件下黃原膠產(chǎn)量為34 g/kg。游離丙酮酸添加量為2 g/L時(shí)，發(fā)酵液黏度為16.0 Pa·s，此時(shí)黃原膠的膠體性能達(dá)到最好。

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Optim ization of fermentation conditions of xanthan gum-producing Xanthomonas campestris mutants

ZHANG Chaofeng，F(xiàn)AN Lijun，LI Qingm in，CHEN Weiping，ZHANG Fengying
（College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchnag 330045，China）

The fermentation conditions of xanthan gum producing Xanthom onas campestris C2that screened from rotted roots of cabbage were optimized.The medium composition（carbon source，nitrogen source and their concentration）and fermentation conditions（inoculum，fermentation time，temperature，pH and medium volume）were optim ized by single factor experiment.To improve the colloidal properties of xanthan gum，different amount of free pyruvic acid was added into the medium，and the results showed that the optimal liquid fermentation medium composition was sucrose 55 g/L and fishmeal 10 g/L.When the X.campestris C2was inoculated under the condition of inoculum 4%，pH 7，temperature 28℃，rotation speed 130 r/min and fermentation time 60 h，the production of xanthan gum was 34 g/kg.When adding free pyruvic acid 2 g/L in the medium，the fermentation viscosity was 16.0 Pa·s，and colloid performance was the optimal.

Xanthom onas campestris；xanthan gum；fermentation viscosity

TQ920．1

0254-5071（2016）05-0092-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．019

2015-12-14

江西省科技計(jì)劃（20151BBF60039）

張超鳳（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。

張鳳英（1964-），女，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。