（+）γ-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選鑒定及其部分酶學(xué)特性研究

張旭姣，遲乃玉，2，王　強，王曉輝，金連豆，張慶芳*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

（+）γ-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選鑒定及其部分酶學(xué)特性研究

張旭姣1，遲乃玉1，2，王強1，王曉輝1，金連豆1，張慶芳1*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

以N-乙酰-L苯丙氨酸為唯一碳源進(jìn)行初篩，手性HPLC測酶活力進(jìn)行復(fù)篩，從海泥、海水、土壤等環(huán)境中篩選到一株（+）γ-內(nèi)酰胺降解菌BH24。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，菌株BH24鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），為獲?。?）γ-內(nèi)酰胺酶提供了一種新的菌源。來源于菌株BH24的（+）γ-內(nèi)酰胺酶，最適溫度為28℃，最適pH值為7.0。

（+）γ-內(nèi)酰胺酶；蘇云金芽孢桿菌；鑒定；酶學(xué)特性

γ-內(nèi)酰胺酶（EC 3.5.2.-）是催化酰胺類化合物γ-內(nèi)酰胺酰胺鍵的一種新型酰胺酶（EC 3.5.1.4）［1］。光學(xué)純的（-）γ-內(nèi)酰胺是制備抗病毒藥物的手性中間體［2］，是抗艾滋病藥物（-）阿巴卡韋和（-）卡巴韋的合成原料，也是抗流感藥物帕拉米韋的合成原料。（+）γ-內(nèi)酰胺酶能夠高效率動力學(xué)拆分外消旋體γ-內(nèi)酰胺，獲得光學(xué)純的（-）γ-內(nèi)酰胺［3］。此外，γ-內(nèi)酰胺酶催化外消旋體γ-內(nèi)酰胺還可獲得不同構(gòu)型的γ-氨基丁酸類似物（γ-aminobutyric acid，GABA）［4］。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動，具有很高的生理活性［5-6］。因此有必要分離該對映體混合物，在此基礎(chǔ)上合成其他碳環(huán)核苷類藥物。運用生物酶法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)（-）γ-內(nèi)酰胺，具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物光學(xué)純度高，環(huán)境友好等優(yōu)點［6］。目前該方法的研究主要集中在篩選具有高對映選擇性的（+）γ-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生菌株［7，13］?，F(xiàn)有微生物（+）γ-內(nèi)酰胺酶分別來源于Rhodococcus sp.［7］，Pseudomonas solanacearum［7］，Pseudomonas fluorescens［1］，Aureoacterium sp.［1，8］，Comomonas acidovorans［9］，Sulfolobus solfataricus［3］，M icrobacterium hydrocarbonoxydans［10-13］和Delftia sp.［14］。從環(huán)境微生物中分離篩選出一株高產(chǎn)（+）γ-內(nèi)酰胺酶菌株BH24，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA序列分析鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，并對其產(chǎn)（+）γ-內(nèi)酰胺酶的部分酶學(xué)特性進(jìn)行研究，為酶法制備（-）γ-內(nèi)酰胺提供一株新的菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菌種篩選自大黑山土壤，鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），命名為菌株BH24：大連大學(xué)遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

異丙醇、乙腈、正丁醇（均為色譜純），其他試劑（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

菌株發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，KH2PO47.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO40.4 g/L，F(xiàn)eSO40.02 g/L，CaCl20.02 g/L，NH4Cl 5.0 g/L，調(diào)節(jié)pH7.0。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：日本島津公司；CHIRALPAKAS-H手性色譜柱（250 mm×4.6 mm）：日本大賽璐公司。

1.3方法

1.3.1菌株初篩

大連海域海水、海泥及大黑山土壤樣品共20份，海水5 m L，海泥、土壤各取2.0 g左右加入10 m L無菌生理鹽水，充分混勻，待靜置后取上清接種于富集培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d，按5%的接種量轉(zhuǎn)入相同富集培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2 d。采用平板劃線分離法，將富集培養(yǎng)后的菌液適度稀釋，涂布在平板篩選培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)。菌株在2～5 d后陸續(xù)生長，挑取單菌落進(jìn)行進(jìn)一步純化，并將純化后的菌株進(jìn)行斜面保藏，用于進(jìn)一步活性測定。然后將離心獲得的濕菌經(jīng)0.05 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次以上，直至發(fā)酵液洗凈為止，將洗滌后的菌體懸浮于質(zhì)量濃度為10 g/L的N-乙酰-L-苯丙氨酸的上述磷酸鹽緩沖液中。在28℃、150 r/min條件下反應(yīng)8 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液，用茚三酮比色法測定氨基酸的方法測定轉(zhuǎn)化率。將能轉(zhuǎn)化N-乙酰-L-苯丙氨酸的32菌株進(jìn)行保藏待用。

1.3.2菌株復(fù)篩

將初篩獲得的菌株接入種子培養(yǎng)基中在28℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，按5%的接種量轉(zhuǎn)入相同種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/m in培養(yǎng)24 h，按5%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、150 r/m in培養(yǎng)24 h。然后將離心獲得的濕菌經(jīng)0.05 mol/L，pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次以上，直至發(fā)酵液洗凈為止，將洗滌后的菌體懸浮于質(zhì)量濃度為10 g/L的N-乙酰-L-苯丙氨酸的上述磷酸鹽緩沖液中。在28℃、150 r/min條件下反應(yīng)，在10 h后取樣，手性HPLC分析檢測轉(zhuǎn)化后樣品中（±）γ-內(nèi)酰胺成分的變化，將具有較高（+）γ-內(nèi)酰胺酶活性的菌株保藏待用。

1.3.3酶活測定方法

取發(fā)酵液8 000 r/m in離心15 m in，離心獲得的濕菌經(jīng)0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）洗滌3次以上，直至發(fā)酵液洗凈為止，將洗滌后的菌體懸浮于質(zhì)量濃度為10 g/L的N-乙酰-L-苯丙氨酸的上述磷酸鹽緩沖液中，溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/m in條件下反應(yīng)30 m in（反應(yīng)初速度線性范圍內(nèi)）。10 000 r/min離心10 m in，取上清液。上清液經(jīng)正丁醇萃取后，再經(jīng)有機濾膜過濾制成上樣樣品，每組實驗平行3次。手性HPLC分析檢測轉(zhuǎn)化后樣品中（±）γ-內(nèi)酰胺的濃度，并計算每升發(fā)酵液的酶活（U/L）。

酶活定義：在28℃條件下，每分鐘水解1 μmol（+）γ-內(nèi)酰胺所需要的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.3.4菌株鑒定

（1）細(xì)菌形態(tài)觀察

LB平板上，觀察細(xì)菌生長情況及菌落特征。革蘭氏染色，觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

（2）菌株生理生化特征鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［15］進(jìn)行生理生化實驗。主要包括氫氧化鉀拉絲試驗、淀粉水解試驗、油脂水解試驗、明膠水解試驗、石蕊牛乳試驗、糖發(fā)酵試驗、甲基紅試驗、VP試驗、檸檬酸鹽試驗、硫化氫試驗、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗。

（3）16S rDNA的擴增與分析

對分離篩選到的（+）γ-內(nèi)酰胺酶菌株BH24進(jìn)行菌株鑒定。用一對細(xì)菌16S rDNA基因序列的通用引物5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行PCR擴增，擴增后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析，根據(jù)分析結(jié)果對菌株BH24進(jìn)行種屬鑒定［16］，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

（1）粗酶液樣品制備

取發(fā)酵液8 000 r/min離心15min，得到的濕菌體經(jīng)磷酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）洗滌3次，將菌體懸于緩沖液中（0.05 mol/L，pH 7.0），進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎后10 000 r/m in離心，取上清液為粗酶液。

（2）粗酶液最適反應(yīng)溫度的確定

將菌株BH24（+）γ-內(nèi)酰胺酶粗酶樣品添加到等體積（±）γ-內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度10 g/L的緩沖液中（0.05 m ol/L，pH 7.0），分別置于8℃、18℃、28℃、38℃、48℃、58℃、68℃。搖床轉(zhuǎn)速150 r/m in條件下反應(yīng)30 m in，10 000 r/m in離心，取上清液。上清液經(jīng)正丁醇萃取后，再經(jīng)有機濾膜過濾制成上樣樣品，每組實驗平行3次。手性HPLC分析上樣樣品中（±）γ-內(nèi)酰胺的質(zhì)量濃度，計算酶活（U/L）。相對酶活計算以同組最高酶活為100%。

（3）菌株粗酶液最適pH的確定

將BH24（+）γ-內(nèi)酰胺酶粗酶樣品添加到等體積（±）γ-內(nèi)酰胺質(zhì)量濃度為10g/L的緩沖液中，調(diào)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下反應(yīng)30 m in，10 000 r/m in離心，取上清液，后續(xù)方法同上。

（4）菌株酶的pH穩(wěn)定性

將BH24（+）γ-內(nèi)酰胺酶粗酶液樣品分別調(diào)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于28℃恒溫箱保溫2 h。取出后再調(diào)整pH值為7.0，150 r/min條件下反應(yīng)30 min，10 000 r/m in離心，取上清液，后續(xù)方法同上。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選及形態(tài)特征

實驗室從大連海域海水、海泥及大黑山土壤樣品中，經(jīng)過初篩篩選到菌株32株，復(fù)篩篩選到菌株12株，從中獲得一株高產(chǎn)（+）γ-內(nèi)酰胺酶菌株，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶穩(wěn)定，命名為BH24。其菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見圖1。

圖1　菌株BH24菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Colonial morphology and gram staining results of strain BH24

由圖1可知，該菌株在LB培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)1～2 d，菌落乳白色、圓形、不透明，革蘭氏染色呈陽性。

2.2生理生化鑒定結(jié)果

菌株BH24的生理生化特征試驗結(jié)果見表1。

表1　菌株BH24的生理生化特征Table 1 Physiologica l and biochem ica l charac teristics o f strain BH24

由表1可知，菌株BH24能夠分解淀粉、油脂、明膠、葡萄糖、乳糖。過氧化氫酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽試驗結(jié)果為陽性，氫氧化鉀拉絲、甲基紅、VP、硫化氫試驗結(jié)果為陰性。

2.316S rDNA鑒定結(jié)果

菌株BH24經(jīng)PCR擴增電泳，結(jié)果見圖2；Neighbor-Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果見圖3。

由圖2可知，進(jìn)行序列測定，得到長度為1455bp的序列。16S rDNA序列比對分析的結(jié)果（圖3）顯示，該序列與蘇云金芽孢桿菌的16S rDNA的序列同源性達(dá)100%。故將菌株BH24鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

圖2　菌株BH24 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Elec trophoregram of strain BH24 16S rDNA PCR am plification products

圖3　菌株BH24 16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain BH24 based on 16S rDNA gene sequence

2.4酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.4.1酶作用的最適溫度

圖4　酶最適作用溫度曲線Fig 4 Optimal temperature curve of enzyme

由圖4可知，（+）γ-內(nèi)酰胺酶最適作用溫度為28℃。說明該酶在中低溫環(huán)境下，酶活能保持較高水平，這對于以（-）γ-內(nèi)酰胺為原料的藥物合成具有重要意義。

2.4.2酶作用的最適pH及穩(wěn)定性

圖5　酶的最適pH及其穩(wěn)定性曲線Fig.5 Optimal pH and stability curve of enzyme

由圖5可知，該（+）γ-內(nèi)酰胺酶的最適作用pH值為7.0。在pH值為8.0時，該（+）γ-內(nèi)酰胺酶酶活為pH值為7.0時的90%左右。該（+）γ-內(nèi)酰胺酶的pH穩(wěn)定性曲線表明，當(dāng)pH值為6.0～8.5時，該（+）γ-內(nèi)酰胺酶酶活力能保存80%以上，該酶在中性環(huán)境下，穩(wěn)定性最好。因此，選擇pH值7.0為該酶的最適作用和保藏的pH值。

3　結(jié)論

由于試驗中采用的底物外消旋體γ-內(nèi)酰胺比較昂貴，所以本研究采用兩步篩選的方法。在篩選過程中發(fā)現(xiàn)，在初篩平板上可以生長的菌株，用茚三酮方法卻測不出酶活，原因可能是：N-乙酰-L-苯丙氨酸水解后產(chǎn)生的苯丙氨酸作為營養(yǎng)物質(zhì)被微生物所利用，致使菌株不能表現(xiàn)出活力；或者是較先生長出的菌株分泌的物質(zhì)使后續(xù)生長出的菌株得以生長。經(jīng)過手性HPLC分析，菌株BH24具有最高酶活力和立體選擇性。通過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA序列測定，菌株BH24鑒定為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。該酶的最適作用溫度為28℃，最適pH 7.0，在pH為6.0～8.5中性條件下，該酶穩(wěn)定性良好。與QIN X X等［13-15］研究的（+）γ-內(nèi)酰胺酶酶學(xué)性質(zhì)基本一致。菌株BH24是一株新的（+）γ-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌，活性及穩(wěn)定性良好，具有潛在開發(fā)價值，為獲?。?）γ-內(nèi)酰胺酶提供了一種新的菌源。有關(guān)該（+）γ-內(nèi)酰胺酶的分離純化及工業(yè)發(fā)酵等實驗室在進(jìn)一步深入研究。

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Isolation and identification of a（+）γ-lactamases producing strain and preliminary study on its enzymatic properties

ZHANG Xujiao1，CHI Naiyu1，2，WANG Qiang1，WANG Xiaohui1，JIN Liandou1，ZHANG Qingfang1*
（1.Liaoning Marine M icrobial Engineering and Techno logy Center，Co llege of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Using N-acetyl-L-phenylalanine as sole carbon source，prelim inary screening was conducted，and then enzyme activity was detected by chiral HPLC for second screening.A（+）γ-lactam degrading strain BH24 was screened from sea mud，seawater，soil environment.Through strain morphological characteristics，physiological and biochemical，16S rDNA sequence identification and phylogenetic analysis，the strain BH24 was identified as Bacillus thuringiensis.The results provided a new source for acquiring（+）γ-lactamase.The optimum temperature and pH of（+）γ-lactamase from strain BH24 was 28℃and 7.0.

（+）γ-lactam；Bacillus thuringiensis；identification；enzymatic characteristics

Q939

0254-5071（2016）05-0052-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．011

2016-03-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（No.2007AA021306）

張旭姣（1988-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。

張慶芳（1965-），女，教授，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。