一株褐藻酸裂解酶高產(chǎn)菌的篩選及其酶學性質(zhì)研究

陳洪基，姜國良*，閆廣思

（中國海洋大學海洋生命學院，山東青島266003）

一株褐藻酸裂解酶高產(chǎn)菌的篩選及其酶學性質(zhì)研究

陳洪基，姜國良*，閆廣思

（中國海洋大學海洋生命學院，山東青島266003）

從腐爛的海帶中篩選出一株褐藻酸裂解酶（A ly）高產(chǎn)菌，經(jīng)形態(tài)學分析、生理生化特征和分子水平鑒定，該菌為交替假單胞菌屬，命名為Pseudoalteromonas sp.EE258。利用硫酸銨沉淀、快流速DEAE-瓊脂糖凝膠（DEAE-sepharose Fast Flow）和丙烯葡聚糖凝膠（Sephacryl S-100）柱層析等方法，對Pseudoalteromonas sp.EE258產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶A ly-EE258進行分離純化，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測定該酶的分子質(zhì)量為23 ku。酶學性質(zhì)研究顯示：該酶的最適反應溫度為40℃，最適反應pH值為7.0，在20℃以下時穩(wěn)定性較好，Ca2+和Ba2+能明顯提高酶的活性，F(xiàn)e2+、A l3+、Mg2+和乙二胺四乙酸（EDTA）抑制酶的活性。Aly-EE258能不同程度地裂解褐藻酸、聚古洛糖醛酸和聚甘露糖醛酸，其中聚甘露糖醛酸裂解后主要產(chǎn)生單一的低聚寡糖，在實際應用方面具有重要意義。

交替假單胞菌屬；褐藻酸裂解酶；酶學性質(zhì)

褐藻酸（alginate）是一種大分子線性多糖，β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannose hyaluronic acid，M）和其C5差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通過α-1，4-糖苷鍵結(jié)合形成3種褐藻酸分子：聚β-D-甘露糖醛酸（ploymannuronic acid，PolyM），聚α-L-古羅糖醛酸（poly gulonic hyaluronic acid，PolyG）和雜聚物（ploy mannuronic acid and gulonic hyaluronic acid，PolyMG）［1］。研究發(fā)現(xiàn)，褐藻酸降解產(chǎn)物褐藻酸寡糖具有多種生物活性，包括促生長作用、增強免疫力抗腫瘤活性、誘導子活性、神經(jīng)保護作用等［2-3］，因此其功能性寡糖的開發(fā)在國際上己成為一個研究熱點。

褐藻酸裂解酶是一類多糖裂解酶，通過β-消去反應能夠降解大分子褐藻酸生成低分子量的褐藻酸寡糖或單糖［4］，主要來源于海洋動物、海洋細菌及真菌等［5］。在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫中，目前研究的褐藻酸裂解酶分布在24個多糖裂解酶（polysaccharide lyase，PL）家族中的PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17和PL18家族中［6］，其中，蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)得到解析的褐藻酸裂解酶已有10個。交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas sp.）是由GAUTHIER G等［7］發(fā)現(xiàn)并建立的一個海洋菌屬，廣泛存在于海洋污泥和海洋動植物表面，該菌屬只能從海洋環(huán)境中分離得到。目前，交替假單胞菌產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶、κ-卡拉膠酶、甲殼素酶、右旋糖酐酶和幾丁質(zhì)酶等［8-10］的報道較多，但是產(chǎn)褐藻酸裂解酶方面的研究還較少。交替假單胞菌產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶可以制備諸多生物活性的海藻寡糖，并且與其他菌屬產(chǎn)生的褐藻酸裂解酶性質(zhì)差異明顯，因此開展交替假單胞菌產(chǎn)褐藻酸裂解酶的研究具有很大的開發(fā)和應用價值。

本研究從腐爛的海帶中分離出了一株褐藻酸裂解酶高產(chǎn)菌，通過形態(tài)學、生理生化特征及16S rDNA序列分析進行了鑒定，并對純化得到的褐藻酸裂解酶酶學性質(zhì)進行了研究，以期為褐藻酸裂解酶的研究和應用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品

腐爛的海帶：采自山東榮成海帶養(yǎng)殖廠。

1.1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，（NH4）2SO45.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 25.0 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH 7.5。

斜面培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，NaCl25.0g/L，瓊脂粉15.0g/L，pH 7.5。

復篩與發(fā)酵培養(yǎng)基：褐藻酸鈉5.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母提取物1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 25.0 g/L，pH 7.5。

1.1.3化學試劑

酵母粉：英國Oxoid公司；牛血清白蛋白、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍G-250、十二烷基磺酸鈉：美國Sigma-Aldrich公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris base）：美國Promega公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

Unic2000可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；CF16RXⅡ日立多用途離心機：日立工機有限公司；BS110S精密電子天平：德國Sartorius公司；DK-824電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗儀器有限公司；DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；YC-1層析實驗冷柜：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；BS-100A自動部分收集器：上海青浦瀘西儀器廠。層析柱（1.6 cm×30 cm，1.6 cm×80 cm）：江陰市創(chuàng)通層析設備有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1酶活力和總蛋白含量的測定方法

取1 m L酶樣品和2 m L 1%褐藻酸鈉溶液于試管中，40℃水浴反應30 m in，立即置于沸水浴10 m in終止反應。取1 m L反應液和3 m L 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）于25m L比色管中，置于沸水浴反應5 min，取出后置于冰水浴中迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 m L，在波長550 nm處測定吸光度值［11］。褐藻酸裂解酶活定義：在上述實驗條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μg還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）?？偟鞍缀坎捎肂raford法測定［12］。相關計算公式如下：

1.3.2菌株的篩選

1.3.3菌種鑒定

利用顯微鏡觀察優(yōu)選菌種形態(tài)，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］中生理生化試驗方法，對優(yōu)選菌株進行初步鑒定。

優(yōu)選菌株分子生物學鑒定：利用細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒提取目的菌株的基因組DNA，設計細菌通用引物1：5′-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物2：5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′，以細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到PMD 18-T載體上，測序。將獲得的16S rDNA序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）利用局部序列排比檢索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）工具進行同源性比對，將比對結(jié)果導入MEGA6.0，選用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14］。

1.3.4酶的分離純化

菌株EE258接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，使酶活力達到最高。發(fā)酵液4℃、10 000×g離心10 m in，上清即為粗酶液。粗酶液進行硫酸銨分級鹽析，使硫酸銨飽和度依次達到20%、35%、50%、65%、80%和95%，溶液在冰水浴中緩慢攪拌過夜，離心（4℃、10 000×g離心10 min）后的沉淀用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）溶解，測定不同飽和度下的酶活力，收集活性較高的部分。采用截留分子質(zhì)量為10 ku的超濾濃縮管多次離心（4℃、4 000×g離心10 min）脫鹽，在滲出液中加入BaCl2溶液，若無沉淀生成證明（NH4）2SO4已被除去。

脫鹽后的粗酶液上樣于DEAE-Sepharose FastFlow凝膠柱，用3～4倍柱床體積的初始緩沖液平衡后，用0～0.5 mol/L NaCl洗脫，調(diào)節(jié)恒流泵流速為30 m L/min，每管收集5 m L。測定每管蛋白濃度及褐藻酸裂解酶活力，建立陰離子交換層析洗脫曲線圖。

收集陰離子交換層析后的酶活峰較高的部分，濃縮至2 m L，上Sephacryl S-100過濾層析柱，用初始緩沖液洗脫，流速30 m L/min，每管收集5 m L。收集酶活峰，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳測定蛋白的純度和分子質(zhì)量。

1.3.5酶學性質(zhì)研究

（1）酶的最適溫度：在pH值為7.5的條件下，以最大酶活力為100%，測定褐藻酸裂解酶在5～65℃（溫度梯度為5℃）范圍內(nèi)的相對酶活，確定酶反應的最適溫度。

全固態(tài)離子選擇性電極因為不含內(nèi)充液，極易微型化、陣列化和制備成一次性的紙質(zhì)電極和塑料柔性電極，受到越來越多研究人員的關注。

（2）酶的最適pH：在最適溫度的條件下，以酶活力最高者為100%，分別于pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的緩沖液體系中測定酶的活力，確定酶反應的最適pH。

（3）酶溫度穩(wěn)定性：取適量的酶在5℃、20℃、30℃、40℃、50℃條件下保溫不同時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h）后，以未處理酶的酶活力為100%，在最適溫度和pH條件下測定剩余酶活力，考察酶的穩(wěn)定性。

（4）金屬離子對酶活性的影響：在酶反應體系中分別加入等體積的金屬離子K+、Ca2+、Na+、Fe2+、Al3+、Mg2+、Ba2+、M n2+和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），使金屬離子的終濃度為10 mmol/L，以不加金屬離子的對照組酶活力為100%，在上述最適溫度和pH條件下測定酶活。

（5）NaCl濃度對酶活性的影響：在酶反應體系中加入NaCl，使終濃度為0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L，以不加NaCl的對照組酶活力為100%，在上述最適溫度和pH條件下測定酶活。

（6）底物特異性及酶解產(chǎn)物：分別配制1%的褐藻酸鈉、PolyM和PolyG底物，加入褐藻酸裂解酶進行反應，用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法分析酶解產(chǎn)物。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種篩選

從取自腐爛海帶的材料中，經(jīng)稀釋涂布，分離能在以褐藻酸鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長的菌株，初篩得到18株具有褐藻酸降解能力的菌株，結(jié)果見圖1a。由圖1a可知，大多數(shù)菌株可以產(chǎn)生透明圈，透明圈的大小可以初步反應菌株的產(chǎn)酶能力。挑取有明顯透明圈的菌株接種于復篩培養(yǎng)基中，測定酶活活性，結(jié)果見圖1b。由圖1b可知，編號為EE258、EE2510和EE2519菌株的酶活較高，相對酶活分別為100%、87.63%和83.87%。通過初篩及復篩，選取能在平板上形成顯著透明圈和酶活最高的菌株EE258，進行后續(xù)研究。

圖1　初篩和復篩結(jié)果Fig.1 Results of primary and secondary screening

2.2菌株EE258菌落及個體形態(tài)特征

對復篩菌株EE258進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察其個體形態(tài)，結(jié)果見圖2。菌株EE258在固體培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，乳白色，無光澤，表面扁平，邊緣粗糙。由圖2可知，菌株EE258呈桿狀，為革蘭氏陰性菌。

圖2　菌株EE258個體形態(tài)Fig.2 Morphology of strain EE258

2.3菌株EE258生理生化特征

EE258不能在厭氧條件下生長，為好氧菌，能在4～35℃生長。菌株EE258能在pH7.0～10.0的條件下生長，最適pH值為7.5。NaCl不是菌株EE258生長必需的物質(zhì)，耐受NaCl的鹽度為0～12%，最適NaCl的濃度為7%。過氧化氫酶和氧化酶反應為陽性，可以利用棉子糖、D-葡萄糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖和鼠李糖等作為碳源，而不能利用其它碳源。根據(jù)形態(tài)特征和生理生化特征，初步將菌株EE258鑒定為交替假單胞菌屬的細菌。

2.4菌株EE258的分子生物學鑒定

通過提取細菌基因組、設計16S rDNA通用引物、PCR擴增，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測（見圖3）。由圖3可知，在1 000～2 000 bp之間形成一條亮帶，說明PCR產(chǎn)物純度很高。

圖3　PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Elec trophoresis of strain EE258 PCR amp lification products

菌株EE258的16S rDNA序列長度為1 410 bp，將序列（GenBank登錄號：KT807786）與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的基因序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株與多株交替假單胞菌屬細菌的16S rDNA基因序列同源性高達99%。由分類地位的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4）可知，菌株EE258與Pseudoal-teromonas arctica NSP519的親緣關系最相近，由此可鑒定該菌為交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas sp.），命名為Pseudoalteromonas sp.EE258。

圖4　菌株EE258基于16S rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain EE258 based on 16S rDNA sequence homology

2.5褐藻酸裂解酶的分離純化

褐藻酸裂解酶粗酶液經(jīng)過硫酸銨分級鹽析、DEAE-sepharose Fast Flow離子交換層析及Sephacryl S-100凝膠過濾，一系列的純化操作，分離純化結(jié)果見表1。由表1可知，經(jīng)過純化后，褐藻酸裂解酶的比活力由48.26 U/mg提升至384.12 U/mg，純化倍數(shù)約7.96，回收率為20.22%。SDS-PAGE凝膠電泳（見圖5）顯示純化后的褐藻酸裂解酶為一條帶，分子質(zhì)量大小約為23 ku，命名為A ly-EE258。

表1　Pseudoalterom onas sp.EE258產(chǎn)褐藻酸裂解酶的純化結(jié)果Table 1 Purification results of alginate lyase from Pseudoa lterom onas sp.EE258

圖5　褐藻酸裂解酶的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.5 Gel electrophoresis o f alginate lyase analysis by SDS-PAGE

2.6A ly-EE258的酶學性質(zhì)分析

2.6.1Aly-EE258酶反應最適溫度和熱穩(wěn)定性

純化后的酶與褐藻酸溶液混合，在不同溫度下（5～65℃）反應，以最高酶活為100%測定相對酶活，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，該酶的最適作用溫度為40℃，當溫度＞60℃時，幾乎沒有酶活。

圖6　溫度對Aly-EE258酶活的影響Fig.6 Effect of tem perature on the enzyme activity of Aly-EE258

將A ly-EE258酶液于5℃、20℃、30℃、40℃、50℃保溫一定時間，并分別于0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h后取樣測量剩余酶活力，計算相對酶活力，結(jié)果見圖7。由圖7可知，酶液在5～20℃下保溫，酶活損失較少，2.0 h后剩余酶活在70%以上；即使在較高溫度下，仍可保持較高的酶活（50℃條件下酶保溫2.0 h，酶活力約為42%）。在低于20℃范圍內(nèi)，酶穩(wěn)定性較好。

圖7　Aly-EE258酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of Aly-EE258

2.6.2Aly-EE258酶反應最適pH

圖8　pH值對Aly-EE258酶活的影響Fig.8 Effect of pH on the enzyme activity of Aly-EE258

將酶液與不同pH的緩沖溶液混合，溶液的pH范圍為5.0～10.0，以最高酶活為100%，測定酶活力，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，酶反應的最適pH值為7.0，在pH 6.5～7.5酶活力都較高，與文獻報道的褐藻酸裂解酶的最適pH值6.0～8.0一致［15］。

2.6.3金屬離子對Aly-EE258酶活性的影響

在酶與底物的反應體系中，加入不同的金屬離子，使其終濃度為10 mmol/L，以不加金屬離子酶液的酶活為100%，得到相對酶活結(jié)果見圖9。由圖9可知，多種金屬離子對Aly-EE258酶的活性都有較大的影響，其中，Ca2+、Ba2+對酶有明顯的激活作用，以Ca2+的激活能力最好；金屬離子Fe2+、A l3+、M g2+會抑制Aly-EE258酶的活性；金屬離子螯合劑EDTA可以強烈抑制純化的A ly-EE258酶活性，表明該純化酶是一種金屬蛋白酶。

圖9　金屬離子對Aly-EE258酶活的影響Fig．9 Effect of me tal ions on the enzym e activity of Aly-EE258

2.6.4NaCl濃度對A ly-EE258酶活性的影響

將純酶液置于不同濃度的NaCl溶液中，以在無NaCl條件下的酶活為對照，測定酶活力，結(jié)果見圖10。由圖10可知，該純化酶在NaCl加入后酶活力有較大程度的提高，其最適的NaCl濃度為0.4 mol/L，在此條件下Aly-EE258酶活性提高了39.5%。且該酶在NaCl濃度＜1.2 mol/L的高鹽條件下的酶活力均高于無NaCl條件的酶活。以上結(jié)果表明Aly-EE258酶具有較強的耐鹽性，在鹽濃度變化較大的環(huán)境下仍然保持較高的酶活。

圖10　NaC l濃度對Aly-EE258酶活的影響Fig．10 Effect of NaCl concentration on the enzyme activity of Aly-EE258

2.6.5底物特異性和產(chǎn)物分析

薄層層析結(jié)果（見圖11）表明，褐藻酸鈉、PolyM和PolyG酶解后產(chǎn)生不同聚合度的褐藻酸寡糖，然而都沒有單糖生成，說明Aly-EE258為內(nèi)切型褐藻酸裂解酶。其中PolyM的酶解產(chǎn)物主要為單一寡糖，在寡糖分離純化技術(shù)上可以節(jié)約大量的成本。

圖11　褐藻酸鈉、PolyM和PolyG酶解產(chǎn)物的薄層層析Fig．11 TLC analysis of enzymatic hydrolysate of alginate，PolyM and PolyG

3　結(jié)論

本研究從腐爛的海帶中分離出一株高產(chǎn)褐藻酸裂解酶菌株，經(jīng)形態(tài)學、生理生化特征和分子水平鑒定，該菌為交替假單胞菌屬，命名為Pseudoalteromonas sp.EE258。褐藻酸裂解酶Aly-EE258的最適反應溫度為40℃，最適反應pH為7.0，在20℃以下時酶的穩(wěn)定性較高，Ca2+、Ba2+對酶有明顯的激活作用，F(xiàn)e2+、Al3+、Mg2+會抑制酶的活性。褐藻酸鈉、PolyM和PolyG均能被A ly-EE258裂解成低聚寡糖，PolyM經(jīng)裂解主要產(chǎn)生單一寡糖。綜上所述，褐藻酸裂解酶Aly-EE258有良好的開發(fā)和應用前景。

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Screening of a high-yield alginate lyase producing strain and its enzymatic properties

CHEN Hongji，JIANG Guoliang*，YAN Guangsi
（College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

A high-yield alginate lyase（A ly）producing strain was screened from rotten kelp.According to morphological analysis，physiological and biochemical characteristics and molecular identification，the strain was identified as Pseudoalteromonas sp.EE258.The A ly-EE258 from Pseudoalterom onas sp.EE258 was separated and purified by ammonium sulfate precipitation，DEAE-sepharose Fast Flow and Sephacryl S-100 column chromatography.The molecular mass of the purified enzyme was about 23 ku by sodium dodecyl sulfate polyacrylam ide gel electrophoresis（SDS-PAGE）. The enzymology properties study showed that the optimum reaction temperature and pH of the enzyme was 40℃and 7.0，respectively.The enzyme had good stability at below 20℃.The enzyme activity was significantly promoted by Ca2+and Ba2+，but inhibited by Fe2+，A l3+，Mg2+and EDTA.The A ly-EE258 could degrade alginate，poly gulonic hyaluronic acid（PolyG）and ploymannuronic acid（PolyM）inordinately.PolyM could be mainly degraded into single oligosaccharide，which had great significance in practical application.

Pseudoalterom onas sp.；alginate lyase；enzymatic properties

S968．42

0254-5071（2016）05-0025-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．006

2016-01-31

國家自然科學基金（No.31101876）；山東省自然科學基金（No.20102RE29047）

陳洪基（1989-），男，碩士研究生，研究方向為資源生態(tài)學。

姜國良（1963-），男，教授，本科，研究方向為海洋生物材料與活性物質(zhì)方面的研究。