伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA的克隆與分析

黃偉，馮作山，張培嶺，白羽嘉（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA的克隆與分析

黃偉，馮作山，張培嶺，白羽嘉*
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

以“卡拉克塞”伽師瓜為試驗(yàn)材料，采用甜瓜基因組輔助設(shè)計(jì)超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）基因擴(kuò)增引物。以伽師瓜cDNA為模板克隆超氧化物歧化酶基因CDS區(qū)序列，獲得三條超氧化物歧化酶基因序列，分別命名為JSGSOD1（Genebank登錄號(hào)KT160023）、JSGSOD2（Genebank登錄號(hào)KT160024）和JSGSOD3（Genebank登錄號(hào)KT160025），序列長度分別為987bp、804bp和459 bp。伽師瓜SOD與甜瓜SOD具有高度的同源性。JSGSOD1含CuSOD結(jié)構(gòu)域，JSGSOD2含F(xiàn)eSOD家族結(jié)構(gòu)域，而JSGSOD3含Cu/ZnSOD家族結(jié)構(gòu)域。并利用相關(guān)軟件對(duì)其理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞器定位進(jìn)行了預(yù)測分析。

伽師瓜；超氧化物歧化酶；克??；分析

伽師瓜屬于厚皮甜瓜（Cucumis melo L.）變種，為葫蘆科（Cucurbitaceae）黃瓜屬（Cucumic Linn）甜瓜亞屬（Melo Jeffrey）［1］。因產(chǎn)地在伽師縣而得名，其栽培歷史悠久，當(dāng)?shù)鬲?dú)特的氣候和水土條件賦予了伽師瓜含糖量高，風(fēng)味濃郁，瓜肉清脆爽口等特點(diǎn)，且伽師瓜較耐貯藏，果實(shí)抗病性強(qiáng)，采用傳統(tǒng)的窖藏方式其貯藏期可達(dá)6個(gè)月之久。果實(shí)在貯藏過程中會(huì)產(chǎn)生和積累活性氧，活性氧對(duì)病原微生物產(chǎn)生抑制和殺滅作用，提高果實(shí)抗病性；但活性氧也會(huì)對(duì)植物細(xì)胞膜產(chǎn)生損害，引起采后衰老，從而抗病性降低［2］。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是植物體內(nèi)重要的活性氧清除劑，可調(diào)節(jié)活性氧的平衡，SOD的種類、活性和作用方式與耐藏性和抗病性密切相關(guān)［3］。

1969年，因Mccord等揭示了其催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以將其命名為超氧化物歧化酶［4］。SOD按其所含金屬輔基的不同分為以下四種類型：（1）Cu/Zn-SOD，主要存在于細(xì)胞質(zhì)、葉綠體和過氧化物酶體中，是SOD中含量最豐富的一種［5］，且目前對(duì)其研究較多［6-7］；（2）Mn-SOD，主要存在于真核生物的線粒體中［8］；（3）Fe-SOD，F(xiàn)e金屬輔基的SOD，主要存在于葉綠體中［9］；（4）Ni-SOD，Ni金屬作為輔基的SOD［10］。不同的SOD在植物抗病性、耐藏性和抗逆反應(yīng)中起著不同的作用。伽師瓜的耐藏性和抗病性很強(qiáng)，伽師瓜果實(shí)采后SOD的研究主要集中在SOD酶活性與抗病性、貯藏期的關(guān)系上［11-13］，而有關(guān)SOD基因與其抗病機(jī)制的關(guān)系研究較少，馬偉榮對(duì)伽師瓜Cu/ZnSOD進(jìn)行了克隆并研究了SOD酶活性與表達(dá)量之間的關(guān)系［13］。另外，目前對(duì)甜瓜基因的克隆主要采用同源克?。?3］和RACE［14］的方法，還未見到以甜瓜基因組輔助設(shè)計(jì)引物得到特異性PCR產(chǎn)物的報(bào)道。

本文以新疆伽師瓜為試驗(yàn)材料，通過甜瓜基因組輔助設(shè)計(jì)引物，克隆SOD基因cDNA，預(yù)測分析其結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步了解伽師瓜SOD基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)；該研究也為從基因表達(dá)的角度上揭示伽師瓜貯藏抗病過程中活性氧（如SOD）的調(diào)控機(jī)制提供前期研究基礎(chǔ)；更對(duì)甜瓜抗病育種具有重要的價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

“卡拉克塞”伽師瓜，于2014年9月采自新疆伽師縣英買里鄉(xiāng)。

RNAplant Plus植物總RNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；Thermo Scientific Rvertaid first Strand cDNA Synthesis Kit：美國賽默飛世爾科技；LA Taq DNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker（GM335）、6×DNA Loading Dye、4S Red Plus Nucleic Acid Stain（NB6695）、Tris-base：生工生物工程（上海）有限公司；瓊脂糖，西班牙Biowest公司；冰乙酸、乙二胺四乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設(shè)備

JH-DS型凈化工作臺(tái)：上海鴻都電子科技有限公司；D2012離心機(jī)，大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司；DW-FL90低溫冰箱：中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司；T-100型PCR儀、PowerPac Universal型電泳儀：美國Bio-rad公司；Heraeus Biofuge Primo R型低溫離心機(jī)、美國賽默飛世爾科技；WD-9403C型紫外儀：北京市六一儀器廠；移液器：大龍醫(yī)療設(shè)備（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA克隆的引物設(shè)計(jì)

參照甜瓜基因組（http：//melonomics.net）中的SOD基因，分別以MELO3C014007T1、MELO3C015351T2和MELO3C015374T2為模板，使用ORF Finder和Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA擴(kuò)增引物，結(jié)果見表1。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1伽師瓜SOD基因cDNA的PCR擴(kuò)增引物Table 1　Primer sequences for PCR amplification of superoxide dismutas cDNA of Jiashi melon

1.2.2伽師瓜果肉總RNA的提取

將伽師瓜果肉用液氮快速研磨至粉末狀。按植物總RNA抽提試劑盒方法提取總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄cDNA

按照反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒Thermo Rvertaid first Strand cDNA Synthesis說明書進(jìn)行，產(chǎn)物經(jīng)分裝后保存于-80℃低溫冰箱中。

1.2.4PCR反應(yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）體系總體積為100μL，包括：cDNA模板4μL，上下游引物（10 μM）各2μL，dNTP（10mM）0.8μL，2×GC Buffer I 50μL，ddH2O 40.4μL，LA TaqDNA聚合酶（5U/ μL）0.8μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃5min→94℃30s、Tm℃30s→ 72℃1 min（共33個(gè)循環(huán)）→72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5載體克隆測序

電泳后將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司委托進(jìn)行載體克隆測序。

2　結(jié)果與分析

2.1伽師瓜果肉總RNA提取結(jié)果

伽師瓜果肉總RNA提取結(jié)果見圖1，由圖1可知，28s和18s條帶清晰，可進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄cDNA實(shí)驗(yàn)。

2.2伽師瓜超氧化物歧化酶CDS序列的克隆

以伽師瓜果肉cDNA為模板，克隆伽師瓜SOD編碼蛋白序列，伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，分別得到長度約為987 bp、804 bp和515 bp的DNA片段。采用DNAMAN軟件將測序獲得的序列進(jìn)行拼接，得到伽師瓜超氧化物歧化酶JSGSOD CDS序列；然后使用ORF finder軟件在線分析其CDS序列，結(jié)果見圖3、圖4和圖5，發(fā)現(xiàn)三個(gè)SOD的CDS序列包含起始密碼子和終止密碼子，為全長的開放閱讀框，其長度分別為987 bp、804 bp和459 bp，而編碼蛋白質(zhì)長度分別為328個(gè)、267個(gè)和152個(gè)氨基酸。將序列提交至Genebank，獲得登錄號(hào)，分別為KT160023、KT160024和KT160023。

圖1 伽師瓜果肉RNA提取結(jié)果Fig.1　The RNA isolated result of Jiashi melon

圖2　伽師瓜超氧化物歧化酶cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　The results of Jiashi melon SOD cDNA PCR amplification

圖3　JSGSOD1 CDS的ORF分析Fig.3　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD1 CDS

圖4JSGSOD2 CDS的ORF分析Fig.4　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD2 CDS

圖5JSGSOD3 CDS的ORF分析Fig.5　Analysis of open reading frame（ORF）of JSGSOD3 CDS

2.3伽師瓜超氧化物歧化酶CDS序列的分析

2.3.1系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

采用NCBI在線搜索伽師瓜三個(gè)SOD同源性較高的核苷酸序列并下載，采用MEGA 6.05構(gòu)建核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖6。

圖6 超氧化物歧化酶CDS區(qū)核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6　Phylogenetic tree from nucleotide CDS sequences of different species of Superoxide Dismutase

由圖6得知，超氧化物歧化酶基因可分為兩大類，一類是Cu/ZnSOD，另一類是FeSOD。伽師瓜的三個(gè)SOD均與甜瓜SOD聚為一類，且高度同源。與黃瓜（Cucumis sativus）、筍瓜（Cucurbita maxima）和南瓜（Cucurbita moschata）等其他物種的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。JSGSOD1與甜瓜CuSOD聚為一類，表明只特異性的結(jié)合Cu2+；而JSGSOD3則是Cu/ZnSOD，能結(jié)合Cu2+和Zn2+。

2.3.2JSGSOD蛋白部分理化性質(zhì)預(yù)測分析

使用蛋白質(zhì)分析軟件Protparam對(duì)伽師瓜的三個(gè)SOD理論等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析。JSGSOD2的等電點(diǎn)最高，為7.14，預(yù)測為堿性蛋白質(zhì)；而JSGSOD1和JSGSOD3等電點(diǎn)都小于7，分別為5.16和5.28，預(yù)測是酸性蛋白質(zhì)。伽師瓜 3個(gè) SOD中JSGSOD2的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白；而JSGSOD1和JSGSOD3為穩(wěn)定蛋白。另外，JSGSOD1、JSGSOD2和JSGSOD3的親水性平均數(shù)都為負(fù)數(shù)，預(yù)測均為親水性蛋白。

2.3.3JSGSOD保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析

使用NCBI在線CDS預(yù)測分析伽師瓜3個(gè)SOD的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果見圖7、圖8和圖9。

圖7　JSGSOD1的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.7　Predictive analysis of JSGSOD1 conserved domains

圖8　JSGSOD2的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.8　Predictive analysis of JSGSOD2 conserved domains

圖9　JSGSOD3的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.9　Predictive analysis of JSGSOD3 conserved domains

JSGSOD1具有Cu/ZnSOD超家族保守結(jié)構(gòu)域，且有典型的4個(gè)Cu2+結(jié)合位點(diǎn)，分別與Ser213、Asn215、IIe230和Trl279配位。而活性位點(diǎn)在Ser213、Asn215、IIe230、Asp245和Trl279。只含Cu2+的SOD具有和Cu/ ZnSOD類似的催化機(jī)理。根據(jù)結(jié)果分析JSGSOD2具有FeSOD家族保守結(jié)構(gòu)域。JSGSOD3屬于Cu/ZnSOD家族，具有典型的Cu2+和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)。Cu2+分別與His45、His47、His62和His119配位，而Zn2+則與His62、His70、His79和Asp82配位?；钚晕稽c(diǎn)為His45、His47、His62、His79、Asp82和His119。Cu2+結(jié)合位點(diǎn)、Zn2+結(jié)合位點(diǎn)共同結(jié)合His62形成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。其催化活性中心在Cu部位上，通過Cu2+產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)催化超氧陰離子自由基。

2.3.4JSGSOD亞細(xì)胞器定位分析

使用ProtComp 9.0對(duì)伽師瓜3個(gè)SOD進(jìn)行了亞細(xì)胞器定位預(yù)測分析，結(jié)果見表2。

表2JSGSOD的亞細(xì)胞器定位預(yù)測分析Table 2　Predictive analysis of JSGSOD subcellular organelles

從分析結(jié)果可以看出，JSGSOD1和JSGSOD3預(yù)測亞細(xì)胞器位置位于細(xì)胞質(zhì)的可能性很大，表明這兩個(gè)蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用，而JSGSOD2的亞細(xì)胞器位置預(yù)測在葉綠體。

3　討論與結(jié)論

在受到病原菌侵染等生物脅迫時(shí)，植物體內(nèi)的自由基增加，抗氧化能力下降。而超氧化物歧化酶作為植物清除自由基的主要防線，可將寄主的活性氧水平維持在正常范圍內(nèi)。研究表明Cu/ZnSOD在植物抵抗逆境（如低溫、病蟲害、高鹽等）的過程中起到重要的作用［15］。為了保證準(zhǔn)確性，文中采用了兩種軟件對(duì)3個(gè)SOD的氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的預(yù)測一致。對(duì)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測中發(fā)現(xiàn)JSGSOD3銅鋅離子結(jié)合位點(diǎn)在已報(bào)道的Cu/ZnSOD中是非常保守的［16-17］。經(jīng)過預(yù)測伽師瓜SOD亞細(xì)胞器的位置在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體，符合文獻(xiàn)中相關(guān)的報(bào)道［18］，表明亞細(xì)胞器的位置與SOD的類型有關(guān)。盡管生物信息學(xué)預(yù)測不能保證其準(zhǔn)確性，但是在無法用實(shí)驗(yàn)來確定其結(jié)構(gòu)和功能時(shí)，預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能就成為指導(dǎo)研究者下一步試驗(yàn)的必要任務(wù)。從伽師瓜中克隆超氧化物歧化酶基因，豐富了其基因的多樣性，但對(duì)伽師瓜貯藏過程中SOD表達(dá)情況及預(yù)測中的亞細(xì)胞器定位等還有待進(jìn)一步的研究。

SOD是活性氧清除酶的關(guān)鍵酶，活性氧代謝與與甜瓜的抗病性密切相關(guān)，基因編碼蛋白質(zhì)（酶），酶調(diào)控著果實(shí)的生理活動(dòng)，SOD調(diào)控活性氧代謝。伽師瓜為新疆特有甜瓜品種，其耐藏性強(qiáng)，品質(zhì)好，可作為母本進(jìn)行雜交育種，但國內(nèi)外采用伽師瓜為母本進(jìn)行育種的較少。因此該研究將有助于推廣以伽師瓜為母本進(jìn)行育種，改善甜瓜在貯藏過程中的抗病能力，達(dá)到延長貯運(yùn)期的目的。

本文以新疆伽師瓜cDNA為模板，通過甜瓜基因組輔助設(shè)計(jì)引物，載體克隆測序得到3個(gè)SOD序列，其CDS序列長度分別為987 bp、804 bp和459 bp。經(jīng)過預(yù)測分析JSGSOD1和JSGSOD3屬Cu/ZnSOD，而JSGSOD2屬FeSOD。結(jié)果表明采用甜瓜基因組輔助設(shè)計(jì)引物克隆cDNA是可行的，為甜瓜基因方面的研究提供思路；對(duì)其進(jìn)行的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞器定位和功能預(yù)測分析能幫助我們了解它們的結(jié)構(gòu)和功能，而這些對(duì)指導(dǎo)甜瓜抗病性育種和轉(zhuǎn)基因作物都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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Cloning and Analysis of Jiashi Melon Superoxide Dismutase cDNA

HUANG Wei，F(xiàn)ENG Zuo-shan，ZHANG Pei-ling，BAI Yu-jia*
（College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultual University，Urumuqi 830052，Xinjiang，China）

Melon genome was used to design superoxide dismutase（SOD）gene amplification primers.Three superoxide dismutase gene sequences obtained from“kalakesai”Jiashi melon cDNA were named as JSGSOD1 （Genebank accession number：KT160023），JSGSOD2（Genebank accession number：KT160024）and JSGSOD3 （Genebank accession number：KT160025），sequence lengths were 987 bp，804 bp and 459 bp，respectively. Jiashi melon SOD and melon SOD had a high degree of homology.JSGSOD1 contained CuSOD family domain，JSGSOD2 contained FeSOD family domain，JSGSOD3 contained Cu/ZnSOD family domain.The paper also analyzed its physical and chemical properties and subcellular localization analysis with relevant software.

Jiashi melon；superoxide dismutase；cloning；analysis

2015-09-25

國家自然基金資助項(xiàng)目（31460413）

黃偉（1991—），男（漢），碩士研究生在讀，研究方向：食品科學(xué)。