構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-GFP并鑒定其在大腸桿菌中的表達(dá)*

陸 琤　周晨辰　張鵬飛　張 硌*

構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-2-GFP并鑒定其在大腸桿菌中的表達(dá)*

陸 琤①周晨辰①?gòu)堸i飛①?gòu)?硌①*

目的：構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）的原核表達(dá)質(zhì)粒，用以研究小鼠巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力。方法：編碼GFP的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與雙酶切后的載體pGEX-4T-2相連，將pGEX-4T-2-GFP轉(zhuǎn)化E.coli DH5α提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序后轉(zhuǎn)化E.coli BL21中誘導(dǎo)GST-GFP融合蛋白表達(dá)，將表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌滴入培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的皿中，于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)及大腸桿菌被吞噬情況。結(jié)果：獲得的重組質(zhì)粒測(cè)序正確。熒光顯微鏡下能清晰觀察到培養(yǎng)基中及被巨噬細(xì)胞吞噬后發(fā)綠色熒光的大腸桿菌。結(jié)論：成功構(gòu)建了pGEX-4T-2-GFP重組質(zhì)粒，為研究小鼠巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力創(chuàng)造條件。

綠色熒光蛋白；pGEX-4T-2載體；重組質(zhì)粒；表達(dá)；熒光顯微鏡

［First-author's address］ Department of Medical Engineering， The Affiliated Hospital of Military Medical Sciences，Beijing 100071， China.

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一種在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍光線激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光的蛋白［1］。GFP與傳統(tǒng)的熒光抗體相比，其靈敏度高、無(wú)生物毒性，在酸、堿及加熱等條件下穩(wěn)定，熒光反應(yīng)不需要任何外源反應(yīng)底物，且其表達(dá)無(wú)物種或細(xì)胞組織的專一性，還可以消除因抗體與非靶位點(diǎn)相結(jié)合帶來(lái)的背景熒光的干擾［2-3］。因此，GFP作為一種報(bào)告蛋白，在監(jiān)測(cè)目的基因的表達(dá)、研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及追蹤細(xì)胞系的分化等方面有著極其廣泛的應(yīng)用［4-5］。

GFP的N-端或C-端可以和異質(zhì)蛋白連接組成融合蛋白，既能保留異質(zhì)蛋白的固有特性，又能保留GFP的發(fā)光能力，是良好的報(bào)告蛋白和熒光標(biāo)記分子。因此，GFP融合蛋白實(shí)際上可作為一種“熒光標(biāo)簽”用來(lái)研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用等?；谶@些特點(diǎn)，本研究構(gòu)建能在細(xì)菌中表達(dá)熒光蛋白的pGEX-4T-2-GFP質(zhì)粒來(lái)研究小鼠巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力［6-12］。

1　材料與方法

1.1材料及設(shè)備

（1）原核質(zhì)粒pGEX-4T-2為本實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)菌DH5α、BL21、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA電泳凝膠回收試劑盒均購(gòu)自天根科技生化（北京）有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、Q5 high-fidelity DNA polymerase、dNTPs以及DNA marker均購(gòu)自美國(guó)NEB公司；DNA Ligation Kit購(gòu)自大連TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；異丙基硫代β-D半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

（2）所用實(shí)驗(yàn)儀器為：梯度基因擴(kuò)增（PCR）儀（美國(guó)伯樂(lè)，BIO-RAD，C1000 Touch），GL-1800干式恒溫器（海門其林貝爾儀器制造有限公司），DYY-6D電泳儀（北京市六一儀器廠），WD-9413B凝膠成像分析儀（北京市六一儀器廠），ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），HPX-9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），sartorius 1-14離心機(jī)（德國(guó)希格瑪），EX 450-490 DM 505 BA520熒光倒置顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse Ts 100），BSC系列CLASSⅡTYPE A2生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1GFP基因片段的獲取

本實(shí)驗(yàn)室以GFP-X質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：正向引物-CGCGGATCC ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA，含BamHI酶切位點(diǎn)；反向引物-GGAATTCCCG TTATTTGTATAGTTCATCCATGCC，含EcoRI酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為98 ℃、10 s，70 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2GFP原核質(zhì)粒的構(gòu)建

分別使用BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-4T-2 和PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切結(jié)果正確后，凝膠回收載體片段和目的片段。將pGEX-4T-2 與GFP用DNA Ligation Kit 16 ℃連接30 min，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至100 μl感受態(tài)細(xì)菌DH5α，涂布在含氨芐青霉素的LB瓊脂平板中，將平板倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。選取3個(gè)陽(yáng)性菌落，擴(kuò)增后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA（提取條件：室溫，離心力13400 g，具體步驟參照天根-高純度質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)），將重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測(cè)序分析，經(jīng)測(cè)序后將構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pGEX-4T-2-GFP。

1.2.3融合蛋白GST-GFP的表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-2-GFP轉(zhuǎn)化BL21，涂布于含氨芐霉素的LB瓊脂平板，將平板倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取轉(zhuǎn)化后的單克隆接種于3 ml含氨芐霉素LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜后，將菌液按1∶100接種到5 ml氨芐LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.5～1.0，往菌液加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃、250 r/min誘導(dǎo)表達(dá)約5 h，收集細(xì)菌。

1.2.4小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬成像

脫臼處死1只小鼠，取其腹腔巨噬細(xì)胞于含胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，在室溫37 ℃、5%的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，1 d后換液，貼壁為腹腔巨噬細(xì)胞。取10 μl表達(dá)融合蛋白GST-GFP的BL21大腸桿菌滴入培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的皿中，37 ℃培養(yǎng)1 h后熒光顯微鏡下觀察吞噬情況。

2　結(jié)果

2.1擴(kuò)增目的基因GFP

以pEGFP-N3質(zhì)粒作為模板，用PCR方法擴(kuò)增目的片段。共設(shè)為3組，即陰性對(duì)照組1、陰性對(duì)照組2和實(shí)驗(yàn)組。其中，陰性對(duì)照阻1，加入dNTP、引物及酶，不加模板；陰性對(duì)照阻2，加入dNTP、引物及模板，不加酶；實(shí)驗(yàn)組，加入dNTP、引物、模板及酶，反應(yīng)結(jié)束后置于1%瓊脂糖凝膠中電泳。因GFP的基因大小為717 bp，因此，在3組中位于500～1000 bp之間的條帶即為GFP，如圖1所示。

圖1　目的基因PCR產(chǎn)物DNA電泳分析圖

2.2巨噬細(xì)胞吞噬成像

轉(zhuǎn)化了pGEX-4T-2-GFP的大腸桿菌體在自然光下即為黃綠色，將其置于顯微鏡下觀察，整個(gè)菌體呈亮綠色，將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和該大腸桿菌于37 ℃孵育1 h后觀察顯示，發(fā)綠色熒光的大腸桿菌部分被巨噬細(xì)胞吞噬，如圖2所示。

圖2　顯微鏡下巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌圖（×40）

3　結(jié)論

本研究中采用pGEX-4T-2原核表達(dá)質(zhì)粒，此類載體含有高效的原核表達(dá)啟動(dòng)子，能夠在感受態(tài)細(xì)菌體內(nèi)高效表達(dá)重組蛋白。而選擇與之連接的GFP是良好的報(bào)告蛋白和熒光標(biāo)記分子［13-15］。本研究結(jié)果顯示，與目前廣泛采用的報(bào)告基因如β-半乳糖苷酶基因、螢火蟲(chóng)熒光素酶基因等相比，GFP有其優(yōu)越之處：①GFP基因表達(dá)的檢測(cè)非常方便，不像其他報(bào)告基因的檢測(cè)需要加入底物；②表達(dá)GFP的細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的長(zhǎng)時(shí)間作用下生長(zhǎng)良好，表明GFP對(duì)細(xì)菌無(wú)毒性，且不干擾細(xì)菌的生長(zhǎng)和功能；③檢測(cè)表達(dá)時(shí)不用將細(xì)菌事先處理，細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)GFP后，熒光顯微鏡下即可看到明亮的綠色熒光，因而可在活細(xì)菌的情況下檢測(cè)基因的表達(dá)［16-18］。

本研究通過(guò)測(cè)序，并于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，成功構(gòu)建了pGEX-4T-2-GFP表達(dá)質(zhì)粒，為直觀研究巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力提供了工具。

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Construction of pGEX-4T-2-GFP prokaryotic expressing plasmid and its protein expression/

LU Cheng， ZHOU Chen-chen， ZHANG Peng-fei， et al//
China Medical Equipment，2016，13（8）：120-122.

Objective： To construct prokaryotic expressing plasmid of GFP gene. Methods： The PCR product of GFP coding sequence， which was digested with EcoR I and BamH I restriction enzymes， was taped into the plasmid pGEX-4T-2. Then pGEX-4T-2-GFP was transformed into E.coli DH5α and plasmid DNA was extracted. The recombinant plasmid was sequenced and then the expression of GST-GFP fusion protein was induced in BL21. After that， the E.coli which expressed GST-GFP fusion protein was transferred into the dish of cultivating macrophages. Fluorescence microscope was utilized to observe the GFP expression and e.coli swallowed. Results： The recombinant plasmid was sequenced correctly. E. coli expressing GFP both in medium and swallowed by macrophages can be observed clearly with the fluorescence microscope. Conclusion： The recombinant prokaryotic expressing plasmid pGEX-4T-2-GFP was successfully constructed， which facilitated the research for phagocytic capacity of macrophage.

Green fluorescent protein； pGEX-4T-2 vector； Recombinant plasmid； Expression； Fluorescence microscope

1672-8270（2016）08-0120-03 ［中圖分類號(hào)］R197.324

A

陸琤，女，（1987- ），碩士，助理工程師。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科，從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究工作。

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.08.038

國(guó)家自然科學(xué)基金（31400739）“PH結(jié)構(gòu)域蛋白PLEKHQ1協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞遷移與激活的機(jī)制研究”；軍事醫(yī)學(xué)創(chuàng)新基金（2015CXJJ29）“PLEKHQ1調(diào)控細(xì)菌性膿毒敗血癥的功能和機(jī)制研究”

①軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程科 北京 100071

marbleluo@126.com

2016-03-03