傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)制備四逆湯的HPLC指紋圖譜對比研究

黃育生，唐洪梅，招遠(yuǎn)明，王　婷，柴玉娜，劉　媛，鐘如帆（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州50006；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州　50405）

傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)制備四逆湯的HPLC指紋圖譜對比研究

黃育生1＊，唐洪梅2#，招遠(yuǎn)明2，王婷1，柴玉娜1，劉媛1，鐘如帆1（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州510405）

目的：建立四逆湯的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對比傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的四逆湯的主要化學(xué)成分組成的差異。方法：采用HPLC法。色譜柱為Kromasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為235 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。以甘草苷色譜峰為參照峰，測定10批四逆湯的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004年A版）進(jìn)行共有峰鑒定和相似度評價(jià)。結(jié)果：10批四逆湯有18個(gè)共有峰，相似度均≥0.982。經(jīng)驗(yàn)證，10批四逆湯指紋圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性，兩種方法制備的10批四逆湯相似度較高。結(jié)論：所建指紋圖譜專屬性強(qiáng)、結(jié)果穩(wěn)定?？蔀樗哪鏈馁|(zhì)量評價(jià)和控制提供依據(jù)；傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的四逆湯在主要化學(xué)成分組成上無明顯差異。

傳統(tǒng)煎法；煎藥機(jī)；四逆湯；指紋圖譜

中藥煎劑是我國醫(yī)療史上歷史最久，至今仍被廣泛應(yīng)用的一種劑型，其符合中醫(yī)辨證施治、隨癥加減、全面兼顧的要求，具有服用方便、療效快的特點(diǎn)。但是，中藥煎劑傳統(tǒng)煎法耗時(shí)長、操作不便，難以適應(yīng)現(xiàn)代生活的快節(jié)奏，而煎藥機(jī)煎藥具有節(jié)能省時(shí)、衛(wèi)生方便等特點(diǎn)，并被應(yīng)用到醫(yī)療機(jī)構(gòu)中為患者服務(wù)。在提高煎藥效率、方便大眾的同時(shí)，這種現(xiàn)代煎藥模式的安全性和有效性也一直是醫(yī)生和患者關(guān)注的問題。筆者以經(jīng)典名方四逆湯為研究對象，采用高效液相色譜法（HPLC），建立指紋圖譜，比較傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的煎劑的主要化學(xué)成分組成的差異，從物質(zhì)基礎(chǔ)上探討煎藥機(jī)煎藥的安全性和有效性，對指導(dǎo)臨床上中藥的煎煮具有一定參考作用。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括G1314F VWD檢測器（美國Agilent公司）；中藥煎藥機(jī)（北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-400KDE型高功率超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2試劑

甘草苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111610-201106，純度：93.7%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3飲片

淡附片（批號：150306821）、炙甘草（批號：150304481）、干姜（批號：150309921）均購自廣東康美藥業(yè)股份有限公司。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液取甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成甘草苷質(zhì)量濃度為125 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2供試品溶液精密量取樣品25 ml，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸干，加甲醇5 ml，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3四逆湯（樣品）（1）傳統(tǒng)煎法按處方取3劑藥材飲片，分別同時(shí)煎煮，每劑附子加水600 ml浸泡30 min后煎1 h，干姜和甘草加水400 ml浸泡30 min后，與先煎的附子一起煎煮，武火煮沸后改用文火煎煮30 min將藥液濾出；藥渣再加水400 ml，武火煮沸后用文火煎煮20 min，藥液濾出。合并所有濾液，濃縮至900 ml（編號：A-1～A-5）。（2）現(xiàn)代煎藥機(jī)法 按處方取3劑藥材飲片，附子加水1 200 ml浸泡30 min后煎1 h，干姜和甘草加水800 ml浸泡30 min后與先煎的附子一起煎煮，武火煮沸后改用文火煎煮30 min，將藥液濾出；藥渣再加水800 ml，武火煮沸后用文火煎煮20 min，藥液濾出。合并所有濾液，濃縮至900 ml（編號B-1～B-5）。

2.2.4單味藥材溶液分取3味藥材飲片，各按“2.2.3”項(xiàng)下傳統(tǒng)煎法制備單一樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備單味藥材溶液。

2.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1精密度試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以甘草苷的保留時(shí)間和峰面積為參照峰，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均＜3%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以甘草苷的保留時(shí)間和峰面積為參照峰，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均＜3%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共5份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以甘草苷的保留時(shí)間和峰面積為參照峰，記錄各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD均＜3%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.4指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn)

2.4.1指紋圖譜的建立取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得特征指紋圖譜，詳見圖1。

2.4.2對照圖譜的生成采用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2004年A版）對10批樣品進(jìn)行對照圖譜擬合。結(jié)果表明，兩種方法制備的10批樣品有18個(gè)共有峰，以7號峰（甘草苷）為參照峰，詳見圖2。

圖1　10批樣品的高效液相色譜圖Fig 1　Overlay plot of HPLC fingerprint of 10 batches of samples

圖2　10批樣品的共有峰高效液相色譜圖Fig 2　HPLC chromatograms of common peaks of 10 batches of samples

2.4.3指紋圖譜中特征峰的鑒定及藥材歸屬取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、四逆湯和單味藥材溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得四逆湯和甘草苷、單味藥材特征指紋圖譜（見圖3）。結(jié)果表明，7號峰為甘草苷，源于炙甘草；2、5、6、9、10、11、12、14、16、17號峰均源于炙甘草；1、3、8號峰源于附子；4、10、13、15、18號峰源于干姜。

圖3　四逆湯對照圖譜與甘草苷、單味藥材圖譜Fig 3　Control HPLC fingerprint of sini decoction and HPLC fingerprint of liquiritin and each herbs

2.4.4相似度分析采用國家藥典委員會(huì)中藥指紋圖譜相似度軟件（2004年A版）對10批樣品的相似度進(jìn)行分析比較（以A-1為對照）。結(jié)果，兩種煎藥方法制備的10批樣品的相似度在0.982～0.997之間，表明傳統(tǒng)煎法和煎藥機(jī)制備的四逆湯相似度極高（見表2）。10批樣品共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積見表3、表4。

3　討論

目前，關(guān)于傳統(tǒng)煎法和現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的煎劑的主要化學(xué)成分的差異性研究有大量的報(bào)道，多是以藥液的浸膏率、某個(gè)或幾個(gè)化學(xué)成分的含量、臨床觀察治愈率等單個(gè)或多個(gè)指標(biāo)綜合評價(jià)對比［1-2］。安小梅等［3］以生脈飲為代表方劑，選擇分光光度計(jì)法和HPLC法分別建立多糖、總皂苷、五味子醇甲的含量測定方法，同時(shí)計(jì)算浸膏率，對于這3個(gè)指標(biāo)，傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)各有優(yōu)劣。唐進(jìn)法等［4］應(yīng)用HPLC、氣相色譜（GC）法對比薄荷、徐長卿、肉桂、丁香、牡丹皮5種飲片在不同時(shí)間點(diǎn)、不同煎煮方法下?lián)]發(fā)性成分的含量差異，結(jié)果表明現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的煎劑的揮發(fā)性成分含量高于傳統(tǒng)煎法。龔建華［5］給對照組患者服用傳統(tǒng)煎法制備的六味地黃湯，給觀察組患者服用現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的六味地黃湯，觀察所煎藥物浸出物的浸出率和患者的治愈率，結(jié)果傳統(tǒng)煎法的浸出率較高，但在治愈率上兩者無明顯差異。

表2　10批樣品相似度評價(jià)結(jié)果Tab 2　Similarity evaluation results of 10 batches of samples

筆者在研究中，同時(shí)選擇了甘草苷、烏頭堿作為參照物，結(jié)果未能測到烏頭堿，這是因?yàn)闉躅^堿性質(zhì)不穩(wěn)定，在炮制過程和提取過程因加熱會(huì)降解成毒性較低的單酯型生物堿［6］。烏頭堿毒性較大，使用不當(dāng)易發(fā)生心律失常，甚至中毒死亡［7-8］；2015年版《中國藥典》規(guī)定生附子的烏頭堿等雙酯型生物堿的總含量不得過0.020%［9］，臨床多用炮制品，常先煎或久煎，以提高用藥安全性。本研究所用炮制后的淡附片中烏頭堿含量極低，再經(jīng)過長時(shí)間煎煮后，其含量也大大減少，所以本研究建立的指紋圖譜未選擇烏頭堿為對照品。

本研究對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.3%磷酸等不同流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行篩選，最后確定乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。檢測波長參照2015年版《中國藥典》中3味藥材含量測定的檢測波長和參考文獻(xiàn)［9-12］，對比了不同波長（235、280、345 nm）指紋圖譜峰的個(gè)數(shù)，結(jié)果以235 nm波長出峰最多。供試品溶液的制備中比較了不同溶度甲醇的提取效果，結(jié)果甲醇提取效果較優(yōu)。

10批四逆湯的指紋圖譜相似度在0.982～0.997之間，說明煎藥機(jī)制備的四逆湯的主要化學(xué)成分組成與傳統(tǒng)煎法基本一致，初步提示現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥可保障臨床用藥的安全性、有效性，后續(xù)研究將繼續(xù)考察兩種四逆湯中雙酯型生物堿新烏頭堿、次烏頭堿以及單酯型生物堿苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等的含量差異，為現(xiàn)代煎藥機(jī)煎煮的安全、有效性提供更充足的證據(jù)。

表3　10批樣品共有峰的相對保留時(shí)間Tab 3　Relative retention time of common peaks of 10 batches of samples

表4　10批樣品共有峰的相對峰面積Tab 4　Relative peak area of common peaks of 10 batches of samples

［1］慈慧.煎藥機(jī)和傳統(tǒng)煎藥方法的比較及分析［J］.中國藥事，2011，25（2）：155.

［2］朱雪蓮.煎藥機(jī)煎法對中藥復(fù)方煎劑總浸出物及有效成分的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013，10（7）：121.

［3］安小梅，談靜，宋英.補(bǔ)益類代表方生脈飲煎煮方法的研究［J］.中國藥房，2012，23（35）：3 300.

［4］唐進(jìn)法，李學(xué)林.中藥煎藥機(jī)對飲片中揮發(fā)性成分煎出量影響的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（13）：89.

［5］龔建華.傳統(tǒng)煎藥與現(xiàn)代自動(dòng)煎藥機(jī)煎藥的療效研究［J］.臨床合理用藥雜志，2013，6（12C）：156.

［6］張意涵，楊昌林，黃志芳，等.附子煎煮過程中13種生物堿含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究［J］.藥物分析雜志，2015，22 （1）：16.

［7］呂桂玲，張一民，宋興芳，等.653例含烏頭堿類藥物致不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析［J］.中國藥房，2007，18（5）：374.

［8］韓旭，侯婭婕.烏頭堿藥理作用及毒性研究進(jìn)展［J］.中國處方藥，2014（12）：149.

［9］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：14、87、191.

［10］盧葦，梁光義，楊玉琴，等.四逆湯HPLC指紋圖譜研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24（3）：661.

［11］劉曉，范林乾，蔡皓，等.RP-HPLC同時(shí)測定四逆湯中3種雙酯型烏頭堿的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（22）：105.

［12］李瑩，章津銘，傅超美，等.不同方法制備四逆湯中化學(xué)成分對比研究［J］.中成藥，2012，34（4）：673.

（編輯：張靜）

Comparative Study on the HPLC Fingerprint of Sini Decoction Prepared by Traditional Decoction and Modern Machine Decoction

HUANG Yusheng1，TANG Hongmei2，ZHAO Yuanming2，WANG Ting1，CHAI Yu’na1，LIU Yuan1，ZHONG Rufan1（1.The First Clinical Medical College of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510006，China；2.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprints for Sini decoction and compare the differences of compositions of Sini decoction prepared by traditional decoction and modern machine decoction.METHODS：HPLC was performed on the column of Kromasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 235 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.The HPLC fingerprints of 10 batches of Sini decoction were determined with reference peak of liquiritin peaks，and common peak identification and similarity evaluation were conducted by using Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：There were 18 common peaks and the similarity was no less than 0.982.According to the verification，the fingerprint of 10 batches of Sini decoction showed good similarity with reference fingerprint，and the similarity of 10 batches of Sini decoction was high，which was prepared by the 2 methods.CONCLUSIONS：The established fingerprint is specific and stable，and can provide reference for quality evaluation and control for Sini decoction；and there are no obvious differences in the main chemical compositions of Sini decoction prepared by traditional decoction and modern machine decoction.

Traditional decoction；Decoction machine；Sini decoction；Fingerprint

R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3440-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.40

＊博士研究生。研究方向：中藥新藥開發(fā)與安全性評價(jià)。E-mail：huangsheng87@163.com

主任中藥師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新藥開發(fā)與安全性評價(jià)。E-mail：tanghongmei2000@163.com

2015-11-27

2016-03-01）