高效分子排阻色譜法測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的含量

李喆宇，張靜霞，王宇馳，張春然，徐明琴，王瑛瑛，董宏波，王　婷，唐克慧#（.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所/成都抗生素創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，成都　6005；.滇虹藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，昆明　65006）

高效分子排阻色譜法測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的含量

李喆宇1＊，張靜霞1，王宇馳1，張春然1，徐明琴1，王瑛瑛1，董宏波1，王婷2，唐克慧1#（1.成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所/成都抗生素創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，成都610052；2.滇虹藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，昆明650106）

目的：建立測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物含量的方法。方法：采用高效分子排阻色譜法。色譜柱為Sephadex G-10，流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液［0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61∶39，V/V）］（pH7.0），流動(dòng)相B為水，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為200 μl。結(jié)果：丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.07～103.30 μg/ml（r=0.999 4）；定量限為10.4 ng、檢測(cè)限為4.1 ng；精密度、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的含量測(cè)定。

丙二醇頭孢曲嗪；聚合物；高效分子排阻色譜法

丙二醇頭孢曲嗪（Cefatrizine propylene glycol）為頭孢曲嗪的原料藥形式［1］，是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有很高的穩(wěn)定性，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌具有廣譜抗菌活性，主要用于治療革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌引起的感染［2-3］。其臨床中較常見(jiàn)的不良反應(yīng)是藥物所致的過(guò)敏性休克，且經(jīng)研究證實(shí)［4-7］，此類藥物所致的過(guò)敏性休克與藥物中存在的聚合物有關(guān)。β-內(nèi)酰胺類抗生素中的各種聚合物雖然結(jié)構(gòu)不同，但通常具有相似的生物學(xué)特性（如致過(guò)敏性），故在質(zhì)量控制中一般只需控制聚合物總量［8］。由于丙二醇頭孢曲嗪原料藥并未載入《中國(guó)藥典》，且其聚合物檢查也未載入任何國(guó)家藥典，也尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，建立測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物含量的方法，對(duì)控制該藥中聚合物含量，預(yù)防過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生具有重要意義。近年來(lái)，高效分子排阻色譜（HPSEC）法逐漸成熟，并廣泛用于分析抗生素中的高分子雜質(zhì)［9-11］。本試驗(yàn)參考2015年版《中國(guó)藥典》（二部）同類品種中聚合物的測(cè)定方法，采用HPSEC法建立適合測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物含量的方法。

1　材料

1.1儀器

LC-20AT型HPLC儀，包括LC-20AT泵、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱（日本Shimadzu公司）；XS205型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2藥品與試劑

丙二醇頭孢曲嗪原料藥（四川抗菌素工業(yè)研究所化學(xué)研究部自制，編號(hào)：S1、S2、S3）；丙二醇頭孢曲嗪對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140680-201303，純度：95.3%）；藍(lán)色葡聚糖2000（美國(guó)Pharmacia公司，批號(hào)：17-0043-01，純度：100%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Sephadex G-10（300 mm×10.0 mm，40～120 μm）；流動(dòng)相A：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液［0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61∶39，V/V）］（pH7.0），流動(dòng)相B：水；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：200 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1稀釋液取磷酸二氫鈉約1.19 g，精密稱定，置于1 000 ml量瓶中，加水溶解并定容，用磷酸調(diào)pH至4.0，即為磷酸二氫鈉緩沖液，取該緩沖液和乙腈適量，混合搖勻，制成濃度為0.01 mol/L的磷酸二氫鈉緩沖液-乙腈（8∶2，V/V）混合溶液，即為稀釋液。

2.2.2對(duì)照品溶液取丙二醇頭孢曲嗪對(duì)照品適量，精密稱定，加稀釋液溶解，制成丙二醇頭孢曲嗪質(zhì)量濃度為40 μg/ml的對(duì)照品溶液。

專業(yè)特色實(shí)踐是深化校企合作而形成一種特色實(shí)踐教學(xué)模式。學(xué)習(xí)將操作技能要求較高的專業(yè)課程進(jìn)行拆分，理論教學(xué)安排在學(xué)校完成，實(shí)踐教學(xué)安排在上海實(shí)踐基地完成。實(shí)踐教學(xué)由上?；释⒕频昙瘓F(tuán)經(jīng)驗(yàn)豐富的師資團(tuán)隊(duì)來(lái)承擔(dān)，充分利用酒店資源，讓學(xué)生在酒店前臺(tái)、客房、餐飲三個(gè)部門進(jìn)行真實(shí)工作場(chǎng)景的實(shí)踐操作學(xué)習(xí)。

2.2.3供試品溶液取樣品約0.1g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加稀釋液溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.4藍(lán)色葡聚糖2000溶液取藍(lán)色葡聚糖2000適量，加水溶解并稀釋，制成藍(lán)色葡聚糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml的溶液。

2.2.5系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液取樣品約0.1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加2 ml乙腈溶解，再加藍(lán)色葡聚糖2000溶液定容，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.5”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液200 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，供試品溶液中聚合物峰保留時(shí)間（7.640 min）和對(duì)照品溶液丙二醇頭孢曲嗪峰的保留時(shí)間（7.661 min）與相應(yīng)色譜系統(tǒng)（流動(dòng)相A、流動(dòng)相B）中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時(shí)間（7.511、7.291 min）的比值分別為1.017、1.051，兩種流動(dòng)相系統(tǒng)中藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時(shí)間比值為1.030，系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液中聚合物的峰高與單體和高聚體之間的谷高比＞2.0［均符合2015年版《中國(guó)藥典》（二部）的要求］。

圖1　系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖A.在流動(dòng)相A中的藍(lán)色葡聚糖2000；B.在流動(dòng)相B中的藍(lán)色葡聚糖2000；C.在流動(dòng)相B中的對(duì)照品溶液；D.在流動(dòng)相A中的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用溶液；E.在流動(dòng)相A中的供試品溶液Fig 1　Chromatogram of system suitability testA.blue dextran 2000 in mobile phase A；B.blue dextran 2000 in mobile phase B；C.reference substance solution in mobile phase B；D.system suitability solution in mobile phaseA；E.test solution in mobile phaseA

2.4線性關(guān)系考察

取丙二醇頭孢曲嗪對(duì)照品適量，精密稱定，用稀釋液溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分別為1.01、2.02、4.04、6.06、8.08、10.10、11.11、12.12 mg/ml的系列線性溶液，此時(shí)聚合物質(zhì)量濃度分別為2.70、5.40、10.77、16.17、21.57、26.97、29.84、32.43 μg/ml，以流動(dòng)相B為流動(dòng)相，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、聚合物峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的回歸方程為y=2×108x-39 541（r=0.999 4）。結(jié)果表明，丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為2.07～103.30 μg/ml。

2.5定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限為10.4 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限為4.1 ng。

2.6精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液200 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次（以流動(dòng)相B為流動(dòng)相），記錄峰面積，詳見(jiàn)表1。由表1可知，丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物峰面積的RSD=2.99%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、0.5、1.5、3.5、5 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，詳見(jiàn)表2。由表2可知，在0.5 h內(nèi)，丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的峰面積基本不變，但隨著溶液放置時(shí)間的增加，聚合物峰面積顯著增加，因此為保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，供試品溶液應(yīng)在制備后立即測(cè)定。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 1　Results of precision test（n=6）

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab 2　Results of stability test（n=5）

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品適量（編號(hào)：S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并以聚合物峰面積與樣品稱樣量的比值來(lái)考察方法的重復(fù)性，詳見(jiàn)表3。由表3可知，本方法重復(fù)性良好。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of reproducibility test（n=6）

2.9樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算聚合物的含量，結(jié)果3批樣品（編號(hào)：S1、S2、S3）中聚合物的含量分別為0.18%、0.27%、0.37%。

3　討論

3.1流速的選擇

低流速可使供試品溶液中所含樣品與色譜柱填料凝膠基質(zhì)充分平衡，從而達(dá)到理想的分離效果，但流速過(guò)低會(huì)造成凝膠床內(nèi)的橫向擴(kuò)散增大、縫寬變寬、分辨率降低，此外還延長(zhǎng)了樣品洗脫時(shí)間，降低了工作效率。高流速易引起聚合物峰與樣品峰重疊，使原本可以分開(kāi)的組分重合，無(wú)法有效分離，并且柱壓增大，縮短色譜柱的使用壽命。故流速不宜過(guò)低也不宜過(guò)高。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，在流動(dòng)相A中，當(dāng)流速為1.0 ml/min時(shí)，供試品溶液中丙二醇頭孢曲嗪峰與聚合物峰分離度良好，且出峰時(shí)間適宜。因此，本試驗(yàn)的流速選擇1.0 ml/min。

3.2流動(dòng)相A的pH選擇

流動(dòng)相的pH影響聚合物與主峰的分離度，故對(duì)流動(dòng)相A 的pH進(jìn)行考察。分別以pH7.0（A1）、pH8.0（A2）的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，兩種流動(dòng)相系統(tǒng)均能測(cè)得丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物。但在流動(dòng)相A1系統(tǒng)中，聚合物峰呈現(xiàn)良好峰形，與主峰分離良好，有利于聚合物的準(zhǔn)確測(cè)定；在流動(dòng)相A2系統(tǒng)中，主峰前呈現(xiàn)兩個(gè)聚合物峰，不利于聚合物含量的測(cè)定。因此，以pH7.0磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相A。

3.3流動(dòng)相A緩沖鹽濃度的選擇

一定濃度的鹽溶液能防止樣品與凝膠之間的相互作用，改善拖尾等情況，預(yù)試驗(yàn)分別選擇0.005、0.010、0.025、0.075、0.100 mol/L磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相A進(jìn)行考察。結(jié)果表明，鹽濃度過(guò)低時(shí)，聚合物達(dá)不到有效分離；鹽濃度過(guò)高時(shí)，基線波動(dòng)劇烈；而緩沖鹽濃度為0.010 mol/L時(shí)，基線平穩(wěn)，峰形良好，符合2015年版《中國(guó)藥典》（二部）的相關(guān)要求。因此，選擇0.010 mol/L為本試驗(yàn)緩沖鹽濃度。

3.4流動(dòng)相B的選擇

分別以超純水、0.5%葡萄糖溶液、0.01 mol/L十二烷基硫酸鈉溶液3種洗脫液進(jìn)行流動(dòng)相B的篩選。結(jié)果表明，丙二醇頭孢曲嗪對(duì)照品在0.5%葡萄糖溶液、0.01 mol/L十二烷基硫酸鈉溶液作為流動(dòng)相B的條件下進(jìn)行測(cè)定，聚合物峰對(duì)稱性較差、色譜柱柱效低；而超純水為流動(dòng)相B時(shí)，各色譜峰峰形良好，色譜柱柱效高，可達(dá)到檢測(cè)要求。因此，本試驗(yàn)選擇超純水為流動(dòng)相B。

3.5回收率的考察

由于聚合物是一類由千百個(gè)原子彼此以共價(jià)鍵結(jié)合形成相對(duì)分子質(zhì)量特別大、具有重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的化合物的統(tǒng)稱。故無(wú)法獲得丙二醇頭孢曲嗪聚合物的對(duì)照品，因此無(wú)法進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，且本品為原料藥，無(wú)任何輔料干擾，也無(wú)需進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

綜上所述，本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于測(cè)定丙二醇頭孢曲嗪原料藥中聚合物的含量。

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（編輯：劉柳）

Content Determination of Polymer in Acitve Pharmacentical lngredient Cefatrizine Propylene Glycol by High Performance Size Exclusion Chromatography

LI Zheyu1，ZHANG Jingxia1，WANG Yuchi1，ZHANG Chunran1，XU Mingqin1，WANG Yingying1，DONG Hongbo1，WANG Ting2，TANG Kehui1（1.Chengdu University Sichuan Industrial Institute of Antibiotics/Chengdu Engineering Research Center of Innovative Antibiotics，Chengdu 610052，China；2.Dihon Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Kunming 650106，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of polymer in cefatrizine propylene glycol/METHODS：High performance sephadex gel chromatography was performed on the column of Sephadex G-10 with mobile phase A of 0.01 mol/L phosphate buffer［0.01 mol/L Disodium hydrogen phosphate solution-0.01 mol/L Sodium dihydrogen phosphate solution （61∶39，V/V）］（pH7.0）and mobile phase B of water at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 254 nm，column temperature was 30℃，and volume injection was 200 μl.RESULTS：The linear range of polymer was 2.07-103.30 mg/ml（r=0.999 4）；the limit of quantitation of 10.4 ng，limit of detection was 4.1 ng；RSDs of precision and reprodicibility tests were lower than 3%/CONCLUSIONS：The method is specific with high sensitivity and good reproducibility，and can be used for the content determination of polymer in active pharmacentical ingredient cefatrizine propylene glycol.

Cefatrizine propylene glycol；Polymer；High performance size exclusion chromatography

R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3434-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.38

＊研究實(shí)習(xí)員，碩士。研究方向：藥物的質(zhì)量控制和雜質(zhì)。電話：028-84216044。E-mail：lizheyubm@163.com

研究員。研究方向：藥物的質(zhì)量控制和雜質(zhì)。E-mail：765239091@qq.com

2016-01-06

2016-06-03）