HPLC法測(cè)定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量

吳桂凡，黃清泉，謝培德，羅　軼（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧　530021）

HPLC法測(cè)定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量

吳桂凡＊，黃清泉，謝培德，羅軼（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧530021）

目的：建立測(cè)定溪黃草藥材中迷迭香酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Inertsil ODS-SP C18，流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：迷迭香酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5.039～100.776 μg/ml（r=0.999 6）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%；迷迭香酸的加樣回收率為99.53%～104.86%（RSD=2.06%，n=9）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量。

溪黃草；高效液相色譜法；迷迭香酸

溪黃草俗稱熊膽草、血風(fēng)草、黃汁草、香茶菜、手擦黃等，生長(zhǎng)于山谷溪旁潮濕處，新鮮葉片揉搓有棕黃色液汁而得名。其主要分布于長(zhǎng)江以南的湖南、湖北、廣東、廣西、江西、福建等地。溪黃草在南方各地臨床應(yīng)用普遍，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，可用于治療濕熱黃疸、濕熱瀉痢、急性膽炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎、癃閉、跌打瘀腫等疾?。?］。但溪黃草來(lái)源復(fù)雜，《中華本草》中溪黃草來(lái)源為唇形科植物溪黃草和線紋香茶菜的全草［2］；《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第二冊(cè)）中溪黃草植物來(lái)源為唇形科植物線紋香茶菜的干燥地上部分［3］；而《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第二冊(cè)）將來(lái)源為溪黃草的藥材命名為藍(lán)花柴胡［3］，分為線紋香茶菜和溪黃草兩個(gè)不同的藥材來(lái)源；《廣東中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第二冊(cè)）將溪黃草來(lái)源分為線紋香茶菜以及其變種纖花香茶菜或溪黃草［4］。現(xiàn)主要栽培的品種為線紋香茶菜Isodon lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara、纖花香茶菜I.lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara var.graciliflorus（Benth.）H.Hara和溪黃草I.serra Maxim.，此3個(gè)品種在野外也有分布。隨著中藥發(fā)展及中成藥生產(chǎn)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，溪黃草的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，但地方標(biāo)準(zhǔn)只有顯微鑒別和薄層鑒別，未制定含量測(cè)定指標(biāo)。為此，筆者以溪黃草主要栽培的3個(gè)品種為對(duì)象，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其迷迭香酸的含量，以期為溪黃草藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括二極管陣列（DAD）檢測(cè)器、G1329B型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；CP224S型萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；XP205型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；MILLI-QA10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）

1.2試劑

迷迭香酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111871-201203，純度＞98.8%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

1.3藥材

溪黃草藥材經(jīng)筆者實(shí)地采集，以及自廣東、廣西、福建、河南、河北等地購(gòu)買，經(jīng)廣西食品藥品檢驗(yàn)所中藥民族藥室主管藥師黃清泉鑒定分別為線紋香茶菜 I.lophanthoides （Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara（編號(hào)：XW-1～10）（10份）、纖花香茶菜I.lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）H.Hara var/graciliflorus（Benth.）H.Hara.（編號(hào)：XH-1～10）（10份）和溪黃草I.serra Maxim.（編號(hào)：XHC-1～10）（10份）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液取迷迭香酸對(duì)照品適量，置于50 ml量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成每1 ml含迷迭香酸0.201 6 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液適量，加50%甲醇制成每1 ml含迷迭香酸40 μg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液取樣品粉末適量，過(guò)2號(hào)篩，取約1 g，精密稱定，置于150 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以迷迭香酸峰計(jì)為18 842，保留時(shí)間為54.029 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4線性關(guān)系考察

精密稱取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.25、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，各分別置于10 ml量瓶中，用50%甲醇定容，搖勻，即得不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液。分別精密量取上述系列對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以迷迭香酸的質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得迷迭香酸的回歸方程為y=27.976x-14.797（r= 0.999 6）。結(jié)果表明，迷迭香酸的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為5.039～100.776 μg/ml。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，迷迭香酸峰面積的RSD=0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖1　高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.溪黃草供試品；C.線紋香茶菜供試品；D.纖花香茶菜供試品；1.迷迭香酸Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance of rosmarinic acid；B.test sample of I.lophanthoides；C.test sample of I.lophanthoides；D.test sample of I.lophanthoides；1.rosmarinic acid

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、4、10、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，迷迭香酸峰面積的RSD=0.84%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（編號(hào)：XW-10）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，迷迭香酸峰面積的RSD=2.39%（n=5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（編號(hào)：XW-10）0.5 g，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的迷迭香酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9樣品含量測(cè)定

取不同編號(hào)的樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算迷迭香酸的含量（按干燥品計(jì)），結(jié)果見表3。

3　討論

3.1含量指標(biāo)的選擇

溪黃草主要含酚類、酸類、萜類等［5］，3種來(lái)源的溪黃草均含有酚類化合物迷迭香酸和咖啡酸［6］，這兩種成分均具有抗氧化作用，與溪黃草的抗氧化抗炎作用一致［7］。因在溪黃草中迷迭香酸的相對(duì)含量較大，咖啡酸含量太小，故本試驗(yàn)選擇迷迭香酸為含量控制指標(biāo)。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab 2　Results of recovery test（n=9）

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 3　Results of content determination of sample（n=3）

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)［6，8］通過(guò)DAD檢測(cè)器考察，發(fā)現(xiàn)在327 nm波長(zhǎng)處迷迭香酸有最大吸收，特征圖譜所得的色譜信息也較多，故選擇327 nm為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3對(duì)測(cè)定結(jié)果的分析

由于溪黃草來(lái)源分為3個(gè)種，各地方習(xí)用藥材也不統(tǒng)一［9］，不同種間成分差異也較大［10-12］，即使同種藥材不同產(chǎn)地間成分也存在差異；另外采收季節(jié)不同和干燥方法不同也對(duì)迷迭香酸的含量有較大影響［13］。從測(cè)定的30批溪黃草中迷迭香酸含量結(jié)果來(lái)看，線紋香茶菜含量較高（為0.394%～1.80%），纖花香茶菜次之（為0.150%～0.579%），溪黃草含量最低（為0.055%～0.626%）。表明溪黃草的3個(gè)來(lái)源之間有明顯差異。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定溪黃草藥材中迷迭香酸的含量。

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典：下冊(cè)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997：2 511.

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)：中華本草［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：154-156.

［3］廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊(cè)［S］.南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，1996：268、278.

［4］廣東省食品藥品監(jiān)督管理局.廣東中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊(cè)［S］.廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，2011：347.

［5］謝興亮，盛艷梅.溪黃草研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，30 （4）：494.

［6］魯芹飛，唐海明，陳玲玲，等.狹基線紋香茶菜（溪黃草）咖啡酸和迷迭香酸的薄層鑒別與含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：114.

［7］周丹，劉艾琳，杜冠華.迷迭香酸的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2011，20（7）：594.

［8］陳向東，朱德全，張光大，等.HPLC測(cè)定溪黃草配方顆粒中咖啡酸、牡荊苷、迷迭香酸的含量［J］.中藥材，2013，36 （9）：1 530.

［9］鄧喬華，張為良，王德勤，等.《中國(guó)藥典》2010年版成方制劑中溪黃草基原的探討［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2013，14 （1）：5.

［10］劉方樂(lè)，陳德金，馮秀麗，等.溪黃草的化學(xué)成分研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2016，27（2）：242.

［11］Zhou WT，Xie HH，Wu P，et al.Abietane diterpenoids from Isodon lophanthoides var.graciliflorus and their cytotoxicity［J］.Food Chem，2013（136）：1 110.

［12］唐海明，陳建南，張揚(yáng)，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同來(lái)源溪黃草藥材中8個(gè)水溶性成分的含量［J］.藥物分析雜志，2015，35（2）：228.

［13］馮泓瑞，朱德全，黃松，等.不同采收期、加工方法對(duì)溪黃草中咖啡酸和迷迭香酸含量的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（22）：71.

（編輯：劉柳）

Determination of RosmarinicAcid in Herba Rabdosiae Serrae by HPLC

WU Guifan，HUANG Qingquan，XIE Peide，LUO Yi（Institute for Food and Drug Control in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，China）

OBJECTIVE：To establish a method for rosmarinic acid in Herba Rabdosiae Serrae.METHODS：HPLC method was performed on the column of Inertsil ODS-SP C18with mobile phase of acetonitrile-0.4%phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 327 nm，column temperature was 25℃，and injection volume 10 μl.RESULTS：The linear range of rosmarinic acid was 5.039-100.776 μg/ml（r=0.999 6），RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recovery was 99.53-104.38%（RSD=2.06%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good reproducibility and high accuracy，and can be used for the content determination of rosmarinic acid in Herba Rabdosiae Serrae.

Herba Rabdosiae Serrae；HPLC；Rosmarinic acid

R927.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3422-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.34

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制。電話：0771-5828498。E-mail：26785128@qq.com

2015-08-30

2016-06-16）