HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰合劑中黃芩苷的含量Δ

車坷科，楊　帆，鄧開英#（1.重慶市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，重慶　400014；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶　401121；3.重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶　401121）

HPLC法測(cè)定養(yǎng)陰合劑中黃芩苷的含量Δ

車坷科1＊，楊帆2，3，鄧開英2，3#（1.重慶市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，重慶400014；2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶401121；3.重慶市藥物過(guò)程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121）

目的：建立測(cè)定養(yǎng)陰合劑中黃芩苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SunFire C18，流動(dòng)相為甲醇-水-磷酸（43∶57∶0.2，V/V/V），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：黃芩苷的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.055 75～1.115 μg（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2%；加樣回收率為95.39%～98.44%（RSD=1.19%，n= 6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于養(yǎng)陰合劑中黃芩苷的含量測(cè)定。

養(yǎng)陰合劑；黃芩苷；高效液相色譜法；含量測(cè)定

養(yǎng)陰合劑是重慶市第三人民醫(yī)院耳鼻喉科與藥學(xué)部共同研制的中藥制劑，由黃芩、玄參、地黃、大青葉等7味中藥材組合而成，近40年的臨床使用證明該藥具有滋陰涼血、清熱解毒等功效，對(duì)咽喉腫痛、急慢性咽炎等疾病具有良好的治療效果。目前，《重慶市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2008年版）對(duì)養(yǎng)陰合劑進(jìn)行了收載，但由于該藥組分復(fù)雜，現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其相對(duì)密度、沉淀物、微生物限度等指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，而對(duì)有效成分黃芩苷也僅用了薄層色譜進(jìn)行定性，未制定含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。因此，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-3］，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定養(yǎng)陰合劑中黃芩的活性成分黃芩苷的含量，旨在為完善養(yǎng)陰合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1　材料

1.1儀器

2695型HPLC儀，包括2998二極管陣列檢測(cè)器、EMPOWER色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Simplicity-185型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2藥品與試劑

養(yǎng)陰合劑（重慶市第三人民醫(yī)院自制，編號(hào)：S1、S2、S3，規(guī)格：250 ml/瓶）；黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201117，純度：91.7%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：SunFire C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（43∶57∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液精密稱取黃芩苷對(duì)照品0.012 16 g，置于100 ml量瓶中，加50%乙醇溶解并定容，作為對(duì)照品貯備液；精密量取上述對(duì)照品貯備液5 ml，置于10 ml量瓶中，加50%乙醇定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液精密量取樣品1 ml，置于25 ml量瓶中，加50%乙醇定容，搖勻，靜置1 h，精密量取上清液1 ml，置于10 ml量瓶中，加50%乙醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液按樣品的處方比例和制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，再按”2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)與專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，黃芩苷與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)＞6 000，保留時(shí)間為11.12 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、5、10、15、20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=310 713x-3 294（r=0.999 9）。結(jié)果表明，黃芩苷的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.055 75～1.115 μg。

圖1　高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.黃芩苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.baicalin

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，詳見表1。由表1可知，黃芩苷峰面積的RSD=0.24%（n=6），表明儀器精密度良好。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 1　Results of stability test（n=6）

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，詳見表2。由表2可知，黃芩苷峰面積的RSD=0.81%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（編號(hào)：S1）適量，混勻，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，詳見表3。由表3可知，黃芩苷的平均含量為8.74 mg/ml，RSD=1.74%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Tab 2　Results of stability test（n=5）

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of reproducibility test

精密量取已知含量的同一批樣品（編號(hào)：S1）0.5 ml，共6份，分別置于25 ml量瓶中，分別加入一定質(zhì)量黃芩苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of recovery test（n=6）

2.9樣品含量測(cè)定

取各編號(hào)樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表5。

表5　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab 5　Results of content determination of samples（n=3）

3　討論

3.1流動(dòng)相的選擇

HPLC法測(cè)定中藥復(fù)方制劑中黃芩苷含量的流動(dòng)相系統(tǒng)有甲醇-水-磷酸［1-3］、甲醇-0.2 mol/L磷酸二氫鈉（用磷酸調(diào)pH 至2.7）［3］、甲醇-0.1%磷酸［3-5］、乙腈-0.2%磷酸［6-7］、甲醇-1.5%醋酸［8］、乙腈-1%甲酸［9］、乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鉀［10］、乙腈-0.1 mol/L磷酸［11］、甲醇-0.5%磷酸［12］、甲醇-0.2%磷酸［13］等。本試驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）黃芩藥材項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，并結(jié)合上述相關(guān)文獻(xiàn)，最終選擇甲醇-水-磷酸（43∶57∶0.2， V/V/V）為流動(dòng)相。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)參考2015年版《中國(guó)藥典》（一部）黃芩藥材項(xiàng)下的含量測(cè)定條件，選取黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)280 nm進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果，在此波長(zhǎng)下，對(duì)樣品中黃芩苷的檢測(cè)較靈敏，陰性對(duì)照無(wú)干擾。因此，本試驗(yàn)選擇280 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于養(yǎng)陰合劑中黃芩苷的含量測(cè)定。

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（編輯：劉柳）

Content Determination of Baicalin in Yangyin Mixture by HPLC

CHE Keke1，YANG Fan2，3，DENG Kaiying2，3（1.Dept.of Pharmacy，Chongqing Third People’s Hospital，Chongqing 400014，China；2.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；3.Chongqing Engineering Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing 401121，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of baicalin in Yangyin mixture.METHODS：HPLC was performed on the column of SunFire C18with mobile phase of methnol-water-phosphoric acid（43∶57∶0.2，V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 280 nm，column temperature was 30℃，and the volume injection was 10 μl.RESULTS：The linear range of baicalin was 0.055 75-1.115 μg（r=0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility test were lower than 2%；recovery was 95.39%-98.44%（RSD=1.19%，n=6）.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid and accurate，and suitable for the content determination of baicalin in Yangyin mixture.

Yangyin mixture；Baicalin；HPLC；Determination

R284.1；R927.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3410-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.30

重慶市衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目（No.2015MSXM067）

＊主管藥師，博士研究生。研究方向：醫(yī)院制劑、藥物新劑型與新技術(shù)。電話：023-63501082。E-mail：beayerchoe@163.com

主任藥師。研究方向：藥品質(zhì)量檢測(cè)與質(zhì)量控制。電話：023-86072717。E-mail：dengkaiying6811@sina.com

2015-11-11

2016-06-03）