腺苷A2A受體在孕期酒精暴露抑制新生大鼠RRDA中的研究

齊亞杰鞏憲宇胡冰冰（ 周口市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 周口 466000； 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 45000； 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 45000）

腺苷A2A受體在孕期酒精暴露抑制新生大鼠RRDA中的研究

齊亞杰1鞏憲宇2胡冰冰3
（1 周口市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 周口 466000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 4530003；3 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

目的 探討腺苷A2A受體在孕期酒精暴露中所致子代呼吸抑制中的作用機(jī)制。方法 使用電生理方法研究腺苷A2A受體在孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中樞基本節(jié)律性呼吸放電（rhythmic respiratory discharge activities，RRDA）中的作用，使用Western blot和qRT-PCR檢測延髓呼吸中樞面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)神經(jīng)元腺苷A2A受體（adenosine A2Areceptor）以及受體mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 腺苷A2A受體參與孕期酒精暴露對(duì)子代延髓呼吸中樞抑制作用，孕期酒精暴露降低腺苷A2A受體功能。結(jié)果表現(xiàn)為酒精暴露組延髓面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)神經(jīng)元腺苷A2A受體水平表達(dá)下調(diào)，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 下調(diào)腺苷A2A受體和受體mRNA表達(dá)而降低腺苷A2A受體對(duì)RRRDA的調(diào)節(jié)作用可能是孕期酒精暴露抑制子代延髓中樞呼吸功能的機(jī)制之一。

腺苷A2A；酒精暴露；新生大鼠；RRDA

腺苷A2A受體（adenosine A2Areceptor）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，與突觸傳遞、神經(jīng)元興奮、運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)等作用密切相關(guān)，參與多種生理和病理學(xué)過程［1-2］。酒精暴露能顯著抑制神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元類似細(xì)胞的增殖、大大降低細(xì)胞的存活率。導(dǎo)致DNA損傷引起細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)，基本節(jié)律性呼吸起源于延髓呼吸中樞，而穩(wěn)定的節(jié)律性呼吸是穩(wěn)定機(jī)體功能的根本條件。腺苷A2A受體在腦內(nèi)廣泛分布，參與中樞性呼吸放電活動(dòng)的發(fā)生。延髓呼吸中樞部位的病變是臨床工作中的常見病與多發(fā)病，酗酒引起的中樞性呼吸異常多見。分析延髓呼吸中樞基本節(jié)律性呼吸放電、腺苷A2A受體蛋白及基因表達(dá)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果來探討孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中樞的機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Sprague-Dawley成年大鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心使用其0～3 d的新生大鼠，雌雄不拘。對(duì)照組新生大鼠自然喂養(yǎng)；酒精暴露組自合籠至分娩、哺乳期以8%的酒精為唯一飲用水的成年大鼠。

1.2新生大鼠離體延髓腦片基本節(jié)律性呼吸放電：按照Suzue方法制作離體延髓-脊髓標(biāo)本。BL-420F智能型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)進(jìn)行處理、記錄和分析。所記錄到由腦片產(chǎn)生的RRDA反映了延髓呼吸中樞呼吸功能，將CGS21680和SCH58261分別先溶于10%DMSO，之后用ACSF稀釋，稀釋后使CGS21680的終濃度為20 nmol/L，SCH58261的終濃度為40 nmol/L，DMSO的終濃度不超過0.1%。實(shí)驗(yàn)分2組，分別為對(duì)照組，酒精暴露組，每組6只腦片。

1.3Western Blot檢測受體蛋白表達(dá)：常規(guī)提取總蛋白，蛋白濃度測定，校正濃度，常規(guī)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)滴加兔抗受體濃度比例為1∶150，滴加生物素標(biāo)記的二抗?jié)舛缺壤秊?∶1000，后經(jīng)過ECL發(fā)光，留圖，進(jìn)行半定量分析。

1.4熒光定量qRT-PCR檢測受體mRNA表達(dá)：超凈生物柜中完成，常規(guī)提取法提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用primer5.0軟件校對(duì)設(shè)計(jì)出PCR特異性引物。

2　結(jié) 果

2.1使用ACSF灌流對(duì)照組和酒精暴露組子代大鼠延髓腦片標(biāo)本，測量RRDA的吸氣時(shí)程、呼吸周期、放電積分幅度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組和酒精暴露組在以上各時(shí)間點(diǎn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），60 min內(nèi)穩(wěn)定無衰減，說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头€(wěn)定可靠。經(jīng)單因素方差分析統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，酒精暴露組RRDA的TI縮短，RC延長、IA減弱，酒精暴露組RRDA弱于對(duì)照組。

2.2酒精暴露組腺苷A2A受體蛋白表達(dá)低于對(duì)照組：通過Western Blot方法檢測腺苷A2A受體蛋白表達(dá)的變化，以GAPDH為內(nèi)參照，把對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。腺苷A2A受體蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，見表1。

表1　Western Blot檢測腺苷A2A受體蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n=3）

表1　Western Blot檢測腺苷A2A受體蛋白表達(dá)結(jié)果（±s，n=3）

組別　腺苷A2A受體　t　P對(duì)照組　1.011±0.107　5.022　0.014酒精暴露組　0.637±0.080

2.3酒精暴露組腺苷A2A受體mRNA表達(dá)低于對(duì)照組：通過qRT-PCR方法檢測腺苷A2A受體mRNA表達(dá)的變化，以GAPDH為內(nèi)參照，把對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，酒精暴露組中腺苷A2A受體mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，見表2。

表2　qRT-PCR檢測腺苷A2A受體mRNA表達(dá)結(jié)果（±s，n=3）

表2　qRT-PCR檢測腺苷A2A受體mRNA表達(dá)結(jié)果（±s，n=3）

組別　腺苷A2A受體mRNA　t　P對(duì)照組　1.015±0.134　4.262　0.012酒精暴露組　0.642±0.059

3　討 論

腺苷A2A受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，參與多種生理和病理學(xué)過程，在腦缺血、炎癥、認(rèn)知記憶等方面的調(diào)節(jié)較多見，但腺苷A2A受體在孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸中樞功能中的作用尚不多見，為明確腺苷A2A受體在孕期酒精暴露新生大鼠延髓腦片基本節(jié)律性呼吸放電抑制中的作用，以便進(jìn)一步豐富和完善孕期酒精暴露引起子代呼吸抑制的作用機(jī)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用出生2 d的新生大鼠，制備其含面神經(jīng)后核內(nèi)側(cè)區(qū)的延髓腦片，通過玻璃微吸附電極描記延髓腦片舌下神經(jīng)根的基本節(jié)律性呼吸放電活動(dòng)，來研究腺苷A2A受體是否對(duì)呼吸基本節(jié)律性放電起調(diào)節(jié)作用，為研究孕期酒精暴露對(duì)新生大鼠延髓腦片RRDA的影響，采用神經(jīng)電生理技術(shù)分析結(jié)果示，與對(duì)照組相比，酒精暴露組RRDA的吸氣時(shí)程縮短、放電積分幅度減弱、呼吸周期延長。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析后，結(jié)果提示孕期酒精暴露使子代延髓腦片RRDA興奮性減弱，而RRDA反應(yīng)了延髓的呼吸功能，因此孕期酒精暴露抑制了子代延髓呼吸中樞的呼吸功能。而酒精引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)的機(jī)制是多方面的。在神經(jīng)元突觸形成的關(guān)鍵時(shí)期，孕期酒精暴露抑制神經(jīng)元細(xì)胞增殖和周期，大大降低細(xì)胞的存活率，誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。孕期酒精暴露誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡可通過線粒體途徑和死亡受體途徑，其中主要以死亡受體途徑為主。酒精能通過氧化應(yīng)激作用使活性氧增加、降低細(xì)胞抗氧化能力、線粒體發(fā)生功能障礙及DNA損傷等引起細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)元數(shù)量減少，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)。由于孕期酒精暴露能下調(diào)腺苷A2A受體，使抑制性神經(jīng)遞質(zhì)腺苷和GABA釋放增多，減弱了神經(jīng)元興奮性，抑制呼吸神經(jīng)元，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。孕期酒精暴露抑制子代呼吸也與腺苷A2A受體表達(dá)下調(diào)有關(guān)。孕期酒精暴露通過降低腺苷A2A受體的轉(zhuǎn)錄和翻譯、減少腺苷A2A受體數(shù)量、降低腺苷A2A受體的活性和功能起到了抑制延髓基本節(jié)律性呼吸放電的作用，這可能是孕期酒精暴露抑制子代延髓呼吸功能的機(jī)制之一。

［1］ Nam HW，Bruner RC，Choi DS.Adenosine signaling in striatal circuits and alcohol use disorders ［J］.Mol Cells，2013，36（3）:195-202.

［2］ Takahashi RN，Pamplona FA，Prediger RD.Adenosine receptor antagonists for cognitive dysfunction:a review of animal studies［J］. Front Biosci，2008，13:2614-2632.

R-33

B

1671-8194（2016）22-0037-02