超臨界提取消癥軟膠囊中莪術(shù)等藥材的工藝研究

白小英 王 燕 張?jiān)汽?曹云飛 張 偉*（青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266033）

超臨界提取消癥軟膠囊中莪術(shù)等藥材的工藝研究

白小英 王 燕 張?jiān)汽?曹云飛 張 偉*
（青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266033）

目的 優(yōu)選消癥軟膠囊中三棱、莪術(shù)、香附、肉桂等四味藥的超臨界提取工藝。方法 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以揮發(fā)油和吉馬酮提取率為指標(biāo)，考察萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間三個因素對提取效果的影響。結(jié)果 在CO2流量16 mL/min、藥材粒度為40目條件下，優(yōu)選工藝為萃取溫度45 ℃，萃取壓力25 MPa，萃取時(shí)間1.5 h。結(jié)論 優(yōu)選工藝三次驗(yàn)證試驗(yàn)，揮發(fā)油和吉馬酮提取率均值分別為2.470%（g/g）和1.431 mg/g。樣品提取率高，結(jié)果重復(fù)性好，提取工藝條件穩(wěn)定可行。

消癥軟膠囊；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；超臨界提??；揮發(fā)油；吉馬酮

超臨界CO2提取技術(shù)在中草藥有效成分提取分離研究中已得到廣泛應(yīng)用，尤其對含親脂性、低沸點(diǎn)成分的中草藥明顯優(yōu)于傳統(tǒng)提取、分離技術(shù)。為了充分提取活性組分，本實(shí)驗(yàn)以總揮發(fā)油和消癥軟膠囊中君藥之一的莪術(shù)主要藥效成分吉馬酮為指標(biāo)，采用超臨界CO2提取法，對影響萃取工藝的主要因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究，為該制劑制備工藝提供科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)研究如下。

1　主要儀器、試劑與藥材

SFT-2000 型超臨界萃取設(shè)備（美國SFT公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（自動進(jìn)樣器，四元低壓梯度泵，柱溫箱，紫外檢測器；美國Agilent公司）；LE225D型電子分析天平（德國）；ABY-0502-1-U型艾科浦超純水機(jī)（重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司）；吉馬酮對照品（中國食品藥品鑒定研究院；批號：11165-201204）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；其余試劑皆為分析純。三棱、莪術(shù)、香附、肉桂購自安徽廣印堂中藥股份有限公司，經(jīng)鑒定均符合《中國藥典》2015年版各自的藥材標(biāo)準(zhǔn)，其中莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1吉馬酮含量測定方法學(xué)考察

2.1.1色譜條件［1］：高效液相色譜儀：Agilent1100型高效液相色譜儀；色譜柱：Eclipse XDB-C184.6 mm×15 cm；流動相：乙腈∶水=80∶20；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 mL。

2.1.2對照品溶液的制備：精密稱取吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品5.62 mg于100 mL容量瓶中，用一定量的甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，制成56.200 μg/mL的吉馬酮對照品儲備液溶液，備用。

2.1.3供試品溶液的制備：取超臨界CO2提取藥物（三棱、莪術(shù)、香附、肉桂），40 ℃鼓風(fēng)干燥后，粉碎并過40目篩，準(zhǔn)確稱取1/3處方量的藥物細(xì)粉。置超臨界萃取釜中，設(shè)定CO2流量為14 mL/min，萃取壓力為20 MPa，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間為1.5 h，收集供試品提取液于2 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。取溶于甲醇后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液備用。

2.1.4陰性樣品溶液的制備：按處方方量取三棱、香附、肉桂按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.1.5專屬性實(shí)驗(yàn)：取供試品溶液、對照品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，測定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明處方中其他藥味不干擾吉馬酮的測定，吉馬酮的理論板數(shù)＞8000。

2.1.6線性關(guān)系考察：精密量取“2.1.2”項(xiàng)下的吉馬酮對照品儲備液1、3、5、7、9 mL分別置10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得系列對照品稀釋液（吉馬酮對照品溶液濃度分別為5.620、16.860、28.100、39.340、50.580 mg/mL），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，測定并記錄吉馬酮對照品色譜峰面積，以吉馬酮對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算吉馬酮對照品的回歸方程為：Y=90.575X-39.050，（R2=0.999 6），見圖2。結(jié)果表明吉馬酮對照品在5.620～50.580 mg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1　吉馬酮高效液相色譜圖

圖2　吉馬酮線性關(guān)系考察

2.1.7精密度試驗(yàn)：精密量取吉馬酮對照品溶液（56.200 mg/mL），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測得吉馬酮峰面積，計(jì)算RSD 為1.130%（n=6）。表明該方法精密度良好。

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為1.211%（n=6），表明樣品重復(fù)性較好。

2.1.9穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.1.3”項(xiàng)下樣品溶液適量，分別在室溫放置0、2、4、8、10、12、24 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值為1.523%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的提取物6份，分別精密加入高、中、低3個量的吉馬酮對照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉馬酮的平均回收率為97.970%，RSD為1.409%。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2超臨界提取工藝優(yōu)化研究

2.2.1考察指標(biāo)的選擇：以超臨界CO2提取率和消癥軟膠囊組方藥物中君藥之一的莪術(shù)主要藥效成分吉馬酮為兩個評價(jià)指標(biāo)，各按50%的權(quán)重進(jìn)行綜合評價(jià)考察。

表1　超臨界提取物加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.2實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)：以藥材粒度40目、CO2流量16 mL/min，對萃取溫度、萃取壓力和萃取時(shí)間三個因素，按L9（34）正交設(shè)計(jì)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2，正交實(shí)驗(yàn)方案見表3。

表2　超臨界CO2提取工藝因素水平表

2.2.3超臨界流體萃取實(shí)驗(yàn)：按1/3處方量分別準(zhǔn)確稱取粉碎粒度為40目的三棱、莪術(shù)、香附及肉桂藥物細(xì)粉共9份，裝入超臨界萃取儀的萃取釜內(nèi)，在CO2流量在16 mL/min條件下，分別按表2實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行萃取。收集提取物，4 ℃以下低溫避光密閉保存。

2.2.4揮發(fā)油提取率測定［2］：將9份提取物置揮發(fā)油測定裝置中，按《中國藥典2015版》分別測定揮發(fā)油含量。

2.2.5吉馬酮含量測定：將9份提取物各取約1 mL，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，分別吸取續(xù)濾液各5 μL，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣、測定、計(jì)算吉馬酮提取率，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表3、4。

表3　超臨界CO2提取工藝正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及其計(jì)算分析結(jié)果（n=3）

表4　超臨界CO2提取工藝正交試驗(yàn)方差分析

2.2.6試驗(yàn)結(jié)果及分析：對表3、表4分析可知，影響超臨界提取效果的因素順序依次為：A（萃取溫度）＞B（萃取壓力）＞C（萃取時(shí)間），其中A因素對提取有非常顯著影響（P＜0. 01），B因素有顯著性影響（P ＜0.05），而C因素影響無顯著性差異P＞0.05。最佳超臨界提取工藝組合為A3B3C2?？紤]到C因素對提取無顯著性差異，優(yōu)化工藝設(shè)定為A3B3C1組合，即萃取溫度45 ℃、萃取壓力25 MPa，萃取時(shí)間1.5 h。

2.2.7驗(yàn)證試驗(yàn)：按處方方量的1/3準(zhǔn)確稱取醋三棱、醋莪術(shù)、制香附及肉桂藥粉（40目）3份，在CO2流量在16 mL/min條件下，根據(jù)優(yōu)化提取工藝進(jìn)行提取，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表5。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品結(jié)果重復(fù)率高，所篩選出的工藝條件穩(wěn)定可行，具有可操作性和重復(fù)性。

表5　超臨界CO2提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以揮發(fā)油提取率和吉馬酮兩個指標(biāo)各占50%的權(quán)重進(jìn)行綜合評分，對“消癥軟膠囊”組方藥物中的三棱、莪術(shù)、香附、肉桂四味藥材的超臨界提取工藝進(jìn)行優(yōu)選實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化工藝為藥材粒度40目，CO2流量16 mL/min，萃取溫度45 ℃，萃取壓力25 MPa，萃取時(shí)間1.5 h。三次驗(yàn)證試驗(yàn)揮發(fā)油提取率均值為2.470% （g/g），RSD為1.579%；吉馬酮均值為1.431 mg/g，RSD為1.470%。樣品提取率高，結(jié)果重復(fù)性號，提取工藝條件穩(wěn)定可行。

4　討 論

“消癥軟軟膠囊”組方藥物中的三棱、莪術(shù)、香附、肉桂四味藥材均含有揮發(fā)油，君藥莪術(shù)主要藥效成分之一的吉馬酮含量較高，有一定的抗腫瘤活性，有學(xué)者建議將吉馬酮作為莪術(shù)質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)納入再版藥典中［1］。因此用揮發(fā)油得率和吉馬酮含量兩項(xiàng)指標(biāo)的綜合評分，評價(jià)指標(biāo)更能客觀反映“消癥軟膠囊”組方藥物中莪術(shù)等藥材的超臨界提取工藝。

［1］ 楊木華，楊志文.莪術(shù)揮發(fā)油的提取工藝研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國，2010，21（4）:914.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:四部［S］.2015版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:203.

R282.710.3

B

1671-8194（2016）22-0035-03

青島市2015-2016年度中醫(yī)科研計(jì)劃項(xiàng)目（課題編號：2015-zyy008）

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