菊糖與精氨酸的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究

吳慧倫，張亦鳴，關(guān) 曼，江海云，謝 晶，孫 濤（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

菊糖與精氨酸的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究

吳慧倫，張亦鳴，關(guān) 曼，江海云，謝 晶，孫 濤*
（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

菊糖與精氨酸（菊糖與精氨酸的羰氨比為1∶5）在100℃的條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，制備反應(yīng)10、40和70 h的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，分別標(biāo)記為IR10、IR40以及IR70，考察其美拉德反應(yīng)過(guò)程中的進(jìn)程指標(biāo)（pH、紫外-可見(jiàn)吸光光度值、熒光值）并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行紅外表征，然后對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系的pH呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；紫外-可見(jiàn)光譜在296 nm處的吸收峰隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)；在323 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和408 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光值隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)；各衍生物均保留有菊糖本身的特征吸收峰；衍生物對(duì)DPPH、O2·-的清除能力以及還原能力均低于茶多酚對(duì)照組，但較之于菊糖（對(duì)DPPH清除能力以及還原能力幾乎為0）均有提高，且抗氧化性能隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

菊糖，進(jìn)程指標(biāo)，美拉德反應(yīng)，抗氧化性能

菊糖是一種天然果聚糖，由D-呋喃果糖分子以β-（2，1）糖苷鍵連接生成，每個(gè)菊糖分子末尾以α-（1，2）糖苷鍵連接一個(gè)葡萄糖殘基［1］。菊糖具有調(diào)節(jié)血糖血脂、低熱量、改善腸道環(huán)境以及促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等生理功能［2］，因此常應(yīng)用于保健食品中。我國(guó)擁有豐富的菊糖資源，但對(duì)菊糖的研究與應(yīng)用基礎(chǔ)還比較薄弱。

美拉德反應(yīng)常見(jiàn)于食品加工、生產(chǎn)與儲(chǔ)藏過(guò)程中，其產(chǎn)物中的類(lèi)黑精、還原酮以及一些雜環(huán)化合物等具有一定的抗氧化性，且美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有天然無(wú)毒的特性，因此被期望用于合成抗氧化劑［3-4］。當(dāng)多糖參與美拉德反應(yīng)時(shí)，很多美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性和抑菌性均優(yōu)于多糖本身［5］，其中的某些物質(zhì)抗氧化性質(zhì)可媲美于食品中的很多抗氧化劑。

菊糖在食品加工過(guò)程中能夠發(fā)生美拉德反應(yīng)，在加工巧克力的過(guò)程中，由于加入的菊糖參與美拉德反應(yīng)，能夠有效改善巧克力的風(fēng)味［6］。但對(duì)于菊糖在美拉德反應(yīng)過(guò)程中結(jié)構(gòu)與功能變化的研究還較為罕見(jiàn)。精氨酸是一種較常見(jiàn)的氨基酸，其在很多食品中含量豐富。本文以菊糖和精氨酸進(jìn)行美拉德反應(yīng)，研究反應(yīng)前后菊糖的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的變化，以期為多糖美拉德反應(yīng)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊糖 純度＞97%，購(gòu)自上海普振生物科技有限公司；魯米諾、DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼） 購(gòu)自Sigma公司；茶多酚 購(gòu)自湖州榮凱植物提取有限公司；精氨酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無(wú)水乙醇 均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；島津RF-530Pc熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；DELTA-320型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科技發(fā)展股份有限公司；IFFM-D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司。

1.2 菊糖的美拉德反應(yīng)

稱(chēng)取10.0 g菊糖和0.16 g精氨酸，使得菊糖的羰基與精氨酸的氨基的摩爾比為1∶5，將其溶解于100 mL的二次蒸餾水中，在100℃下進(jìn)行回流反應(yīng)。用乙醇或丙酮提取10、40、70 h的菊糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，直至用茚三酮法不能檢測(cè)到產(chǎn)物中還有精氨酸的存在，烘干得到產(chǎn)物并分別標(biāo)記為IR10、IR40以及IR70。

1.3 測(cè)試表征

在反應(yīng)過(guò)程中，利用pH計(jì)、雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)分別測(cè)美拉德反應(yīng)體系的pH、紫外-可見(jiàn)吸光光度值以及熒光值的變化。

紅外表征在傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行，采用KBr壓片法，測(cè)定的波數(shù)范圍為500～4000 cm-1，分辨率為2 cm-1。

1.4 抗氧化性能測(cè)定

1.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除 取8只試管，分別標(biāo)記為0～7。向1～7號(hào)試管中加入2 mL濃度為10-4mol/L 的DPPH乙醇溶液和不同濃度的樣品溶液，混勻后于33℃條件下避光靜置0.5 h，在517 nm處測(cè)得吸光度為Ai，在0號(hào)試管中加入2 mL去離子水和2 mL DPPH乙醇溶液，測(cè)吸光度為A0，陰性對(duì)照組另取7只試管加入無(wú)水乙醇、樣品各2 mL，測(cè)吸光度為Aj［7］。

1.4.2 對(duì)超氧陰離子自由基O·2-的清除 用0.05 mol/L 的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（pH=10.20）配制1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液以及不同濃度的樣品溶液。0.1 mol/L的鄰苯三酚儲(chǔ)備液是用1×10-3mol/L的鹽酸配制而成，使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。在室溫下，采用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀來(lái)測(cè)定樣品溶液的峰面積Ai以及空白溶液的峰面積A0。經(jīng)SOD、過(guò)氧化氫酶及甘露醇檢測(cè)，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子自由基（O·2-）［8］。

清除率（%）=（A0-Ai）/A0×100

1.4.3 還原能力的測(cè)定 取pH=6.60的0.2 mol/L的磷酸緩沖液、1%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入到2.0 mL不同濃度的樣品溶液中，于50℃條件下水浴20 min，取出后立即于冰水中冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后于3000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入去離子水2.5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，靜置10 min后，于700 nm處測(cè)定其吸光度值。其吸光度值越大，還原能力就越強(qiáng)［9］。1.4.1～1.4.3中均以茶多酚（TP）為對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以上所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值確定。利用t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析（p＜0.05），并采用Origin軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 pH的變化 圖1描述了菊糖與精氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中pH的變化，菊糖與精氨酸的美拉德反應(yīng)體系的初始pH呈堿性，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系的pH呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是由于在美拉德反應(yīng)的過(guò)程中羰基不斷與堿基基團(tuán)-氨基縮合，將游離的氨基封閉［10］，且在反應(yīng)過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生甲酸和乙酸等一些酸類(lèi)物質(zhì)［11］，從而引起pH的下降。

圖1 菊糖與精氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中pH的變化Fig.1 The pH change during Maillard reaction

2.1.2 紫外-可見(jiàn)吸光度的變化 美拉德反應(yīng)的過(guò)程中糖會(huì)發(fā)生易構(gòu)和脫水，產(chǎn)生糠醛類(lèi)物質(zhì)，該類(lèi)物質(zhì)在290 nm左右有特征吸收［12］。由圖2可知，菊糖與精氨酸的美拉德反應(yīng)體系在296 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)前25 h增幅較大，其后增幅則慢慢減緩，表明反應(yīng)過(guò)程中有糠醛類(lèi)物質(zhì)生成且不斷積累，且后期糠醛類(lèi)物質(zhì)積累量減少。這很好地反映了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。

圖2 菊糖與精氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中吸光度的變化Fig.2 The UV-vis absorbance during Maillard reaction

2.1.3 熒光值的變化 如圖3所描述的是菊糖與精氨酸美拉德反應(yīng)體系在323 nm激發(fā)波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)為350～600 nm范圍的熒光值，在408 nm發(fā)射波長(zhǎng)下體系的熒光強(qiáng)度最大，且熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)的進(jìn)行不斷增加，表明了具有熒光性質(zhì)的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的不斷增加。熒光物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的一種指示劑，它能靈敏地反映出美拉德反應(yīng)的過(guò)程［13］。美拉德初期產(chǎn)物經(jīng)過(guò)脫水、重排等會(huì)產(chǎn)生無(wú)色的還原酮與熒光物質(zhì)，而此時(shí)糠醛、脫氧鄰?fù)┨堑炔伙柡偷聂驶衔镌黾樱?4］。

圖3 菊糖與精氨酸美拉德反應(yīng)過(guò)程中熒光值的變化Fig.3 The fluorescence absorbance during Maillard reaction

2.1.4 紅外光譜表征 圖4是菊糖（In）及其與精氨酸（Arg）的美拉德衍生物的紅外光譜圖，由圖4可以看出，菊糖及其美拉德衍生物在1033 cm-1以及875 cm-1處有特征吸收峰，這些峰都是菊糖主鏈特征吸收峰，可作為判定菊糖及其衍生物存在的特征吸收峰［15］。菊糖及其美拉德衍生物在2933 cm-1處的吸收峰為C-H的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰，在1410 cm-1處的吸收峰為C-H的彎曲振動(dòng)所引起的吸收峰。精氨酸的紅外譜圖顯示在1684 cm-1處有吸收峰，此為C=N的特征吸收峰。三種菊糖的美拉德衍生物在1623 cm-1處都有吸收峰，此為C=O的吸收峰［16］，而菊糖在此處沒(méi)有吸收峰，這是因?yàn)榫仗桥c氨基酸在發(fā)生美拉德反應(yīng)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生還原酮等物質(zhì)。

圖4 菊糖與精氨酸美拉德產(chǎn)物的紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of Maillard reaction products

2.2 抗氧化性能分析

2.2.1 對(duì)DPPH自由基的清除 DPPH自由基較穩(wěn)定，其N(xiāo)上有一個(gè)游離電子，它在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm處有特征吸收，當(dāng)DPPH自由基中的孤電子被配對(duì)時(shí)，則該處的吸收會(huì)減弱。且其乙醇溶液也會(huì)褪色，其褪色程度與接受的電子數(shù)有關(guān)，故可利用分光光度法進(jìn)行定量分析［17］。由圖5可知，三種衍生物IR10、IR40、IR70的IC50（對(duì)自由基清除率為50%時(shí)所需的自由基清除劑的濃度）分別為1.73、0.48、0.07 mg/mL，即對(duì)DPPH自由基的清除能力IR70＞IR40＞IR10，對(duì)照組茶多酚TP的IC50為0.02 mg/mL，即茶多酚對(duì)DPPH清除能力優(yōu)于菊糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。而菊糖本身對(duì)DPPH自由基的清除能力很低，這說(shuō)明美拉德反應(yīng)改性對(duì)菊糖的DPPH自由基清除能力有所提高，且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)DPPH自由基的清除能力也隨之增加。

圖5 菊糖與精氨酸美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 Scavenging activity of Maillard reaction products on DPPH radical

2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基（O2·-）的清除 鄰苯三酚在堿性條件下氧化釋放出超氧陰離子自由基（O2·-），O2·-與魯米諾可發(fā)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)出的光可由發(fā)光計(jì)檢測(cè)，自由基清除劑可降低鄰苯三酚自氧化速率，清除產(chǎn)生的O2·-，抑制化學(xué)發(fā)光，從而可定量檢測(cè)出其自由基清除能力［17-18］。由圖6可知，IR70的清除效果最好，其IC50為2.65 mg/mL，IR40次之，IR10的清除效果最差，這三種衍生物對(duì)O2·-的清除效果均低于茶多酚TP對(duì)照組（IC50為0.26），但都優(yōu)于菊糖本身，這說(shuō)明美拉德反改善了菊糖對(duì)O2·-的清除能力，且隨著反應(yīng)

圖6 菊糖與精氨酸美拉德產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基（O·）的清除能力Fig.6 Scavenging activity of Maillard reaction products on superoxide anion

時(shí)間的增加，清除能力增強(qiáng)。這與DPPH自由基清除能力的結(jié)果一致。

2.2.3 還原能力的測(cè)定 還原力的測(cè)定，實(shí)質(zhì)是檢驗(yàn)物質(zhì)是否是良好的電子供應(yīng)者。還原力強(qiáng)的物質(zhì)可與自由基反應(yīng)，使自由基成為較穩(wěn)定的物質(zhì)［17］。研究表明，抗氧化活性和還原力間存在密切的關(guān)系［19］。由圖7可知，在濃度為2.5 mg/mL時(shí)，IR10、IR40、IR70的吸光度分別為0.49、0.71、0.87，對(duì)照組茶多酚TP的吸光度為1.72，菊糖本身的還原能力幾乎為零，即它們還原能力大小順序?yàn)門(mén)P＞IR70＞IR40＞IR10＞In，這與前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖7 菊糖與精氨酸美拉德產(chǎn)物的還原能力Fig.7 Reducing capacity of Maillard reaction products

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以美拉德反應(yīng)為改性手段，對(duì)菊糖美拉德反應(yīng)進(jìn)程及其抗氧化性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菊糖美拉德反應(yīng)體系的pH皆隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而下降，紫外吸光度及熒光值均隨時(shí)間的增加而增強(qiáng)；菊糖與精氨酸的美拉德衍生物的抗氧化性能均優(yōu)于菊糖，并隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的增加，抗氧化性能越來(lái)越好。菊糖本身的抗氧化性能較弱，但其美拉德反應(yīng)過(guò)程中會(huì)生成一些酸類(lèi)物質(zhì)、糠醛類(lèi)物質(zhì)以及熒光類(lèi)物質(zhì)，且隨著反應(yīng)的進(jìn)行這些物質(zhì)不斷積累，故而菊糖衍生物的抗氧化性也在不斷增強(qiáng)，具體機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。這為以后菊糖的美拉德反應(yīng)的研究提供了理論依據(jù)和新的思路。

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The Maillard reaction of inulin with arginine and the antioxidant activity of inulin derivatives

WU Hui-lun，ZHANG Yi-ming，GUAN Man，JIANG Hai-yun，XIE Jing，SUN Tao*
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The Maillard reaction was occurred by heating inulin and arginine（the ratio of amine group in inulin and carbonyl group in arginine was 1∶5）at 100℃.The products of 10，40 and 70 h were prepared and named IR10，IR40 and IR70，respectively.pH，UV-vis absorbance and fluorescence were determined during Maillard reaction and the derivatives were characterized by FTIR.Their antioxidant activities were evaluated.The results revealed that the pH of the reaction system decreased during Maillard reaction.The UV-vis absorbance at 296 nm increased during the reaction.With 323 nm excited wavelength and 408 nm emission wavelength，the fluorescence intensity increased with the increase of reaction time.Infrared spectrum analysis showed that the Maillard derivatives retained the characteristic absorption peaks of inulin.Three kinds of inulin derivatives had weaker antioxidant activity compared with tea polyphenol，but it was stronger than inulin（its abilities to scavenge DPPH and reducing capacity were almost zero）and the antioxidant activity increased with the increase of reaction time.

inulin；process indicators；Maillard reaction；antioxidant activity

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0179-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.028

2015－08－03

吳慧倫（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：多糖的改性，E-mail：963357250@qq.com。

孫濤（1970-），女，博士，副教授，研究方向：多糖的改性及生物功能的開(kāi)發(fā)，E-mail：taosun@shou.edu.cn。

“十二五”國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD38B04）。