苯酚硫酸法測(cè)定萌發(fā)菌HL-003多糖方法的研究

鄭朋朋，李 珊，張 保，楊正濤，戚麗蓉，黃 超，敖新宇（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

苯酚硫酸法測(cè)定萌發(fā)菌HL-003多糖方法的研究

鄭朋朋，李 珊，張 保，楊正濤，戚麗蓉，黃 超，敖新宇*
（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

為確定苯酚硫酸法測(cè)定萌發(fā)菌HL-003多糖的最佳參數(shù)。選取苯酚濃度和濃硫酸量為自變量，檢測(cè)不同苯酚濃度和濃硫酸量下的最大吸收波長(zhǎng)和吸光值，從而確定最佳的苯酚濃度和濃硫酸量，在此基礎(chǔ)上檢驗(yàn)方法的顯色時(shí)間、精密度、線性范圍和回收率。結(jié)果表明：最佳苯酚濃度為5%，濃硫酸量為3.5 mL，最大吸收波長(zhǎng)為488 nm，顯色時(shí)間15 min；葡萄糖濃度在0～200 mg/mL范圍內(nèi)線性良好；在優(yōu)化方法下進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，葡萄糖、胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液多糖測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.474%、1.015%和0.712%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠；本方法對(duì)葡萄糖和葡聚糖的回收率均在99.10%以上，回收率高，與真實(shí)值吻合；通過(guò)測(cè)定，萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028% 和2.998 g/L。

苯酚硫酸法，萌發(fā)菌HL-003，多糖

真菌多糖是指各種真菌的子實(shí)體和菌絲體等所產(chǎn)生的一類高分子化合物［1-3］。國(guó)內(nèi)外已從高等擔(dān)子菌中篩選到幾百種具有生物活性的多糖物質(zhì)，目前真菌多糖類保健品已有上百種之多［4-5］。真菌多糖可應(yīng)用于人類的疾病治療和保健，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗衰老、健胃保肝、降血糖、血脂、血壓等多種功能［6-8］。

萌發(fā)菌HL-003是天麻的萌發(fā)菌，為真菌界擔(dān)子菌門小菇屬（Mycena sp.），屬于高等擔(dān)子菌［9-11］。其中萌發(fā)菌胞內(nèi)多糖具有鎮(zhèn)痛消炎、抗腫瘤、抗菌等生物活性［12-14］。

文獻(xiàn)報(bào)道中，多糖的測(cè)定方法主要分為苯酚硫酸法和蒽酮比色法［15-17］，本研究針對(duì)苯酚硫酸法進(jìn)行研究。在不同文獻(xiàn)中所使用的方法原理均相同，但在苯酚濃度、濃硫酸量、測(cè)定波長(zhǎng)和顯色時(shí)間上存在差異性，沒(méi)有一個(gè)確定的規(guī)范，不能很好地進(jìn)行比較、檢驗(yàn)和使用。本文針對(duì)以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品苯酚硫酸法測(cè)定多糖中的參數(shù)進(jìn)行研究。選取苯酚濃度和濃硫酸量為自變量，檢測(cè)不同濃硫酸量和苯酚濃度下反應(yīng)的最大吸收波長(zhǎng)和吸光值，在此基礎(chǔ)上檢驗(yàn)方法的顯色穩(wěn)定時(shí)間、精密度、線性范圍和回收率，從而確定苯酚硫酸法測(cè)定萌發(fā)菌HL-003多糖的最佳參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萌發(fā)菌HL-003菌株 由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生化教研組提供，對(duì)菌株進(jìn)行活化擴(kuò)繁和液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到萌發(fā)菌HL-003菌絲體與發(fā)酵液；葡聚糖G-10 Sigma公司；乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖 AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HWS-12水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；M20粉碎機(jī)KIKA-WERKE公司；BS224S電子天平 SARTORIUS公司；5430R離心機(jī) Eppendorf公司；TU-1901紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯酚硫酸法方法的優(yōu)化 由于在測(cè)定過(guò)程中，樣品濃度和苯酚濃度是可變的，為了不重復(fù)討論變量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，將樣品量和苯酚量固定在1.0 mL。在實(shí)驗(yàn)中，選用蒸餾水和50 μg/mL葡萄糖溶液作為供試樣品，同時(shí)檢測(cè)不同情況下的最大吸收波長(zhǎng)和吸光值。

1.2.1.1 苯酚濃度的確定 取50 μg/mL葡萄糖溶液1.0 mL到10支具塞試管中，分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的苯酚1.0 mL，再加入98%的濃硫酸4.0 mL，反應(yīng)20 min后，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描最大吸收波長(zhǎng)，并在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。對(duì)照組用1.0 mL蒸餾水替代葡萄糖溶液，其他操作相同。

1.2.1.2 濃硫酸量的確定 取50 μg/mL葡萄糖溶液各1.0 mL到8支具塞試管中，加入5%苯酚1.0 mL，再分別加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 mL的濃硫酸，反應(yīng)20 min后，在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描最大吸收波長(zhǎng)，并在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。對(duì)照組用1.0 mL蒸餾水替代葡萄糖溶液，其他操作相同。

1.2.1.3 顯色時(shí)間的確定 取30 μg/mL葡萄糖溶液1.0 mL于試管中，再依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后，迅速倒入比色皿，在488 nm下進(jìn)行時(shí)間掃描，掃描100 min。

1.2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)、胞外多糖待測(cè)液和50 μg/mL的葡萄糖溶液1.0 mL于三只試管中，再分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應(yīng)15 min，在488 nm下測(cè)定吸光值，每組6個(gè)重復(fù)。

1.2.1.5 線性范圍的確定 準(zhǔn)確配制500 μg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液稀釋成0、50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應(yīng)15 min，在488 nm下測(cè)定吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪曲線。

在確定一定的線性范圍后，將500 μg/mL的葡萄糖儲(chǔ)備液稀釋5倍得到100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再精確配制0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，取各濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應(yīng)15 min，在488 nm下測(cè)定吸光值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn) 配制20、40、60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液和10、30、50 μg/mL的葡萄糖溶液，取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液和葡萄糖溶液各1.0 mL，分別依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應(yīng)15 min，在488 nm下測(cè)定吸光值，每組6個(gè)重復(fù)。

1.2.2 萌發(fā)菌HL-003多糖的提取與測(cè)定

1.2.2.1 胞內(nèi)多糖的提取［18］準(zhǔn)確稱取菌絲體1 g，置于50 mL的離心管中，加入42 mL蒸餾水，在功率為520 W下超聲處理19 min后，在72℃電熱恒溫水浴中浸提2.2 h；5000 r/min離心15 min，將上清液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮為5 mL后，加20 mL無(wú)水乙醇，4℃靜置沉淀15 h；6000 r/min離心10 min，收集多糖沉淀，將沉淀復(fù)溶于水中，定容到100 mL待測(cè)。

1.2.2.2 發(fā)酵液多糖的提取 接種萌發(fā)菌HL-003固體培養(yǎng)菌塊于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫條件下，120 r/min搖床上培養(yǎng)18 d，用4層紗布過(guò)濾，得到發(fā)酵液。準(zhǔn)確移取10 mL發(fā)酵液，置于50 mL的離心管中，加30 mL無(wú)水乙醇，4℃靜置沉淀15 h；6000 r/min離心10 min，收集多糖沉淀，將沉淀復(fù)溶于水中，定容到100 mL待測(cè)。

1.2.2.3 萌發(fā)菌 HL-003多糖的測(cè)定 胞內(nèi)多糖待測(cè)液和發(fā)酵液多糖待測(cè)液稀釋10倍后，分別取1.0 mL，再依次加入5.0%苯酚1.0 mL，濃硫酸3.5 mL，搖勻后反應(yīng)15 min，在488 nm下測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.19839+0.01292C得到多糖含量計(jì)算公式，多糖含量的計(jì)算按照（1）和（2）進(jìn)行。

式中：A為胞內(nèi)多糖待測(cè)液稀釋溶液后吸光值；k為稀釋倍數(shù)，本文k為10。

式中：A為發(fā)酵液多糖待測(cè)液稀釋溶液后吸光值；k為稀釋倍數(shù)，本文k為10。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用Origin 7.5軟件對(duì)1.2.1和1.2.2中所測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚濃度法方法優(yōu)化

2.1.1 苯酚濃度的確定 不同苯酚濃度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響如圖1所示，由圖1（A）可知：苯酚濃度小于5%時(shí)，隨苯酚濃度增加葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)逐漸增大，最大為489 nm；5%～9%濃度范圍內(nèi)葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)維持在489 nm，大于9%時(shí)葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)開始增大。苯酚濃度為1%～3%時(shí)蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)減小1 nm，3%～7%范圍內(nèi)蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)維持在490 nm，苯酚濃度繼續(xù)增加，蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)又開始減小。

圖1 苯酚濃度對(duì)最大波長(zhǎng)和吸光值的影響Fig.1 Effect of phenol concentration on the maximum wavelength and absorbance values

由圖1（B）可知：隨著苯酚濃度增大，葡糖糖溶液的吸光值不斷增加，苯酚濃度從1%～5%時(shí)，葡萄糖溶液的吸光值與苯酚濃度呈現(xiàn)正相關(guān)性，當(dāng)苯酚濃度大于5%之后，葡萄糖溶液的吸光值不繼續(xù)增加，而是在一定范圍內(nèi)波動(dòng)；對(duì)于蒸餾水，整體來(lái)看，苯酚濃度的增大，吸光值有所增加，但是增加的輻度不明顯，整體趨勢(shì)和葡萄糖溶液的相似；綜合對(duì)圖1的結(jié)果分析，5%的苯酚是最佳的苯酚濃度。

2.1.2 濃硫酸量的確定 不同濃硫酸量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響如圖2所示。由圖2（A）可知，濃硫酸量從2～3.5 mL時(shí)，蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)由481 nm增加到489 nm，3.5～4.5 mL時(shí)蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)維持在489 nm，濃硫酸量大于4.5 mL時(shí)蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)又開始增加；濃硫酸量從2～3 mL時(shí)葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)從483 nm增大到488 nm，3～4.5 nm時(shí)最大吸收波長(zhǎng)為488 nm不變，當(dāng)濃硫酸量大于4.5 mL時(shí)，葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)開始減小。

由圖2（B）可知，濃硫酸量增加，葡萄糖溶液和蒸餾水的吸光值及兩者的差值均是先增加，到達(dá)最大值后開始下降；濃硫酸量從2～3.5 mL時(shí)，葡萄糖溶液的吸光值不斷增大，3.5 mL時(shí)吸光值到達(dá)最大值，濃硫酸量繼續(xù)增加，葡萄糖溶液的吸光值開始緩慢減??；濃硫酸量從2～4.5 mL時(shí)，蒸餾水的吸光值不斷增大，吸光值對(duì)濃硫酸量呈現(xiàn)正相關(guān)性，當(dāng)濃硫酸量大于5 mL時(shí)，蒸餾水的吸光值開始下降，從整體趨勢(shì)看，蒸餾水的吸光值變化也與葡萄糖溶液的相似。

圖2 濃硫酸量對(duì)最大波長(zhǎng)和吸光值的影響Fig.2 Effect of volume of concentrated sulfuric acid on the maximum wavelength and absorbance values

通過(guò)對(duì)不同苯酚濃度和不同濃硫酸量對(duì)測(cè)定結(jié)果的分析可知，苯酚濃度5%，濃硫酸量為3.5 mL，葡萄糖溶液和蒸餾水的吸光值差值最大，在此條件下蒸餾水的最大吸收波長(zhǎng)為489 nm。葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)為488 nm。因此最佳的苯酚濃度為5%，最佳濃硫酸量為3.5 mL，由于蒸餾水與葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)只相差1 nm，為統(tǒng)一操作，最佳波長(zhǎng)選取葡萄糖溶液的最大吸收波長(zhǎng)488 nm。

2.1.3 顯色時(shí)間 圖3為吸光值隨顯色時(shí)間的變化圖，由圖3可知，0～5 min時(shí)，吸光值急劇下降，5～10 min時(shí)，吸光值由緩慢下降到維持平衡，10～30 min范圍內(nèi)，吸光值維持在一定值不變，當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，吸光值是一個(gè)非常緩慢的增大過(guò)程。所以10～30 min測(cè)定樣品吸光值最穩(wěn)定，考慮到加入濃硫酸需要一定的操作時(shí)間，以及確保在顯色30 min之前測(cè)定完樣品，確定15 min為最佳顯色時(shí)間。

圖3 顯色時(shí)間對(duì)吸光值的影響Fig.3 Effect of coloration time of absorbance

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，葡萄糖、胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液多糖6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的RSD值分別為0.474%、1.015%和0.712%，由此可見(jiàn)，優(yōu)化的苯酚硫酸法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性好，精密度高，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Results of precision experiments

2.1.5 線性范圍 由朗伯比爾定律可知［19］，測(cè)定的吸光值隨溶液濃度增加而增大，吸光值和溶液濃度成正比關(guān)系，但朗伯比爾定律是在一定溶液濃度范圍內(nèi)成立的，若超出一定濃度范圍，吸光值與溶液濃度將不再成正比例關(guān)系，測(cè)定結(jié)果將無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的計(jì)算，這個(gè)范圍即是線性范圍。

圖4 葡萄糖濃度對(duì)吸光值的影響Fig.4 Effect of glucose concentration on the absorbance value

為考察優(yōu)化后的苯酚硫酸法所適合的葡萄糖濃度的線性范圍，測(cè)定了從0～500 μg/mL的葡萄糖溶液的吸光值，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，葡萄糖溶液濃度在0～200 μg/mL范圍時(shí)，吸光值與濃度呈現(xiàn)正比例關(guān)系，濃度增加吸光值相應(yīng)增大；當(dāng)葡萄糖溶液濃度大于200 μg/mL時(shí)，溶液的吸光值偏離先前的直線，吸光值有一個(gè)急劇增大的過(guò)程，最終超出儀器的檢測(cè)范圍。所以優(yōu)化后的苯酚硫酸法適用的葡萄糖溶液的線性范圍為0～200 μg/mL，在此范圍內(nèi)的R2=0.992。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of glucose

在上述的線性范圍內(nèi)，降低葡萄糖溶液的濃度，制作葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性系數(shù)更大，將可以更加準(zhǔn)確地計(jì)算實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)，葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.19839+0.01292C，R2=0.999。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn) 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，由表可知：10.00、30.00、50.00 μg/mL的葡萄糖溶液測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為1.3854%、0.7263%和0.5478%，回收率分別為99.10%、99.77%和100.14%；20.00、40.00、60.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液測(cè)定結(jié)果的RSD值分別為2.9034%、1.5929%和1.4497%，回收率分別為99.40%、99.18%和99.15%?？梢?jiàn)測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠；葡萄糖與葡聚糖的回收率均大于99.10%，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果回收率高，測(cè)定值能正確反應(yīng)真實(shí)值。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of recovery experiments

2.2 萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)與發(fā)酵液多糖測(cè)定結(jié)果

運(yùn)用1.2.2.3中式（1）和式（2）對(duì)表1中的胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液多糖的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028%和2.998 g/L。

表3 萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)與發(fā)酵液多糖測(cè)定結(jié)果Table3 The measurement results of polysaccharide

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化苯酚硫酸法，得到最佳苯酚濃度為5%，濃硫酸量為3.5 mL，最大吸收波長(zhǎng)為488 nm，顯色時(shí)間15 min；葡萄糖濃度在0～200 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，在優(yōu)化方法下進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，葡萄糖、胞內(nèi)多糖和發(fā)酵液多糖測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.474%、1.015%和0.712%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠；本方法對(duì)葡萄糖和葡聚糖的回收率均在99.10%以上，回收率高，與真實(shí)值吻合；通過(guò)測(cè)定，萌發(fā)菌HL-003胞內(nèi)和發(fā)酵液多糖的含量分別為2.028%和2.998 g/L。因此確定通過(guò)優(yōu)化的苯酚硫酸法具有實(shí)用價(jià)值，可以運(yùn)用到萌發(fā)菌HL-003多糖的測(cè)定以及其他材料中多糖的測(cè)定。

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Study on phenol-sulfuric acid method for determination of polysaccharides from germination fungus HL-003

ZHENG Peng-peng，LI Shan，ZHANG Bao，YANG Zheng-tao，QI Li-rong，HUANG Chao，AO Xin-yu*
（Life Science College，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

In order to determine polysaccharides of germination fungus HL-003，parameters of the phenolsulfuric acid method were optimized.Phenol concentration and volume of concentrated sulfuric acid was the independent variable，the maximum absorption wavelength and absorbance were detected under different concentrations of phenol and concentrated sulfuric acid volume.Immediately，the color of time，precision，linearity and recovery were measured in order to determine the optimum parameters.The results showed that phenol concentration of 5%，concentrated sulfuric acid content of 3.5 mL，the maximum absorption wavelength of 488 nm，coloration time 15 min.The methods had a high precision and recovery results were reliable，and consistent with the true value.The concentration of glucose in the range of 0～200 mg/mL had a good linearity.Intracellular and fermentation of polysaccharide contents were 2.028%and 2.998 g/L，by detecting with optimized method.

phenol-sulfuric acid method；germination fungus HL-003；polysaccharides

TS201.1

A

1002-0306（2016）06-0074-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.006

2015－07－02

鄭朋朋（1990-），男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：1104663437@qq.com。

敖新宇（1978-），男，碩士，副教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail：54700875@qq.com。

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）。