VitC和鋅對(duì)游泳訓(xùn)練大鼠皮膚光老化的協(xié)同防護(hù)作用

張　意，郭志麗，張　勇

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·論著·

VitC和鋅對(duì)游泳訓(xùn)練大鼠皮膚光老化的協(xié)同防護(hù)作用

張意1，郭志麗2，張勇2

目的探討簡(jiǎn)便有效的防護(hù)游泳訓(xùn)練大鼠皮膚光老化的方法。方法行紫外線長(zhǎng)期照射游泳訓(xùn)練大鼠皮膚，予以VitC+鋅灌胃，病理學(xué)方法檢測(cè)大鼠皮膚組織變化，檢測(cè)其皮膚內(nèi)羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，酶聯(lián)免疫吸附方法(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)檢測(cè)皮膚內(nèi)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和骨膜蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 成功建立了游泳訓(xùn)練大鼠皮膚光老化的模型，VitC與鋅聯(lián)用可以保持大鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，維持I型膠原的穩(wěn)定，使皮膚內(nèi)HYP含量升高，增強(qiáng)SOD活性，抑制MDA表達(dá)；可以有效抑制皮膚內(nèi)MMPs升高，促進(jìn)骨膜蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論Vit C與鋅聯(lián)合使用對(duì)于皮膚光老化具有良好的防護(hù)效應(yīng)。

維生素C;鋅;紫外線;光老化;協(xié)同效應(yīng)

當(dāng)前我國周邊安全形勢(shì)非常復(fù)雜，海洋權(quán)益受到嚴(yán)重威脅，對(duì)做好海上軍事斗爭(zhēng)準(zhǔn)備的要求愈發(fā)迫切。面對(duì)新時(shí)期的挑戰(zhàn)，我軍已經(jīng)針對(duì)性開展了多領(lǐng)域各層次的海上軍事訓(xùn)練。海訓(xùn)中官兵面臨的突出問題就是皮膚曬傷[1]。隨著后勤保障研究的深入進(jìn)行，針對(duì)急性皮膚曬傷我軍已經(jīng)探索建立了多種防護(hù)機(jī)制，取得了良好效果。但是由于新時(shí)期斗爭(zhēng)的新要求，海訓(xùn)形勢(shì)往往需要延續(xù)數(shù)月，慢性光曬傷的問題逐漸凸顯出來。光老化就是慢性光曬傷的一種，具有發(fā)病隱蔽、病程遷延，不僅造成多種難治性皮損，還可以誘生惡性腫瘤[2-3]。目前有研究提示，VitC、鋅制劑均具有抗過氧化的作用，有益于防護(hù)皮膚光老化[4-5]。本研究擬建立游泳訓(xùn)練大鼠的皮膚光老化模型，研究VitC和鋅聯(lián)合使用對(duì)光老化的防護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑與設(shè)備紫外線光療儀：(SH-2，UVA 發(fā)射光譜340～400 nm，峰值365 nm，輻照強(qiáng)度: 22 W/cm2；UVB發(fā)射光譜260～350 nm,峰值311 nm，輻照強(qiáng)度：9.5 mW/cm2，均購自上海希格瑪高技術(shù)有限公司)。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)試劑盒購自南京建成生物有限公司，金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)檢測(cè)試劑盒和骨膜蛋白(periostin)檢測(cè)試劑盒購自RD公司。VitC、檸檬酸鋅購自上海拜耳醫(yī)藥有限公司。健康雄性清潔級(jí)SD大鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0006。將動(dòng)物置于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK2015-0028)，大鼠(200±20)g隨機(jī)分為5組(空白對(duì)照組、生理鹽水組、鋅組、VitC組和VitC+鋅組)每組8只，大鼠每4只放入一籠飼養(yǎng)，在相同的自然環(huán)境下(晝夜交替12h)飼養(yǎng)一周，常規(guī)飼養(yǎng)和飲食，無不良因素影響，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始試驗(yàn)。

1.2游泳訓(xùn)練大鼠光輻射模型的建立健康雄性大鼠用脫毛膏脫除大鼠背部5.0 cm×5.0 cm區(qū)域內(nèi)毛發(fā)，置于盛水(30±2) ℃的照射盒內(nèi)，進(jìn)行游泳訓(xùn)練，使其不能在水中保持上浮，取出后尾部受刺激后呈逃避狀態(tài)，難以維持平衡。照射盒上方30 cm處置光源，每次先以UVA照射3 min，休息5 min后以UVB 照射1 min，每次共照射60 min，隔日照射一次，連續(xù)照射，至12周時(shí)終止UV暴露。(每天觀察大鼠背部皮膚表現(xiàn)，出現(xiàn)水泡及糜爛等反應(yīng)立即停止照射，待上述癥狀消失后繼續(xù)照射，直至建模成功)。

1.3治療大鼠的組別與劑量設(shè)置健康雄性大鼠隨機(jī)分組，每組8只：空白對(duì)照組(無UV照射)；生理鹽水組(UV照射，每日予以2.0 mL生理鹽水灌胃)；Zn組(UV照射)，每日予以檸檬酸鋅14.4 mg，2.0 mL溶液灌胃一次；VitC組(UV照射)，每日予以VitC50 mg，2.0 mL溶液灌胃一次；VitC+鋅組(UV照射)，每日予以VitC25 mg+鋅7.2 mg，2.0 mL溶液灌胃一次。

1.4病理學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，斷頸處死動(dòng)物，迅速取背部照射處皮膚組織塊(0.2～1.0 g)用于檢測(cè)，固定后按常規(guī)脫水，石蠟包埋，以皮損最長(zhǎng)徑為中心行5 μm厚度連續(xù)切片，行HE組織染色，檢測(cè)組織學(xué)改變；采用masson三色染色法進(jìn)行I型膠原染色：以weigert鐵蘇木素(weigert鐵蘇木素A、B液等比例混和)染10 min，水洗后以1%鹽酸酒精分化，麗春紅酸性品紅染液染5 min，磷鉬酸溶液處理約5 min，用苯胺藍(lán)人染液復(fù)染5 min，多次脫水后觀察。

1.5皮膚抗氧化指標(biāo)檢測(cè)提取各組皮膚組織，選擇南京建成生物工程研究所的檢測(cè)試劑盒。采用羥胺法檢測(cè)450 nm處紫外吸收峰，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組皮膚SOD活性。采用樣本堿水解法檢測(cè)550 nm處紫外吸收峰，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組皮膚HYP含量。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)520 nm處紫外吸收峰，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組皮膚組織MDA含量。

1.6ELISA法檢測(cè)MMPs表達(dá)水平和骨膜蛋白含量變化選擇RD公司的檢測(cè)試劑盒，按照說明書操作，首先加入裂解液作用裂解各實(shí)驗(yàn)組皮膚組織標(biāo)本，依次加入一抗和二抗，加入顯色液作用30 min，在570 nm 檢測(cè)MMP1、MMP3和骨膜蛋白含量。

2　結(jié)　果

2.1VitC和鋅聯(lián)合使用可以有效防護(hù)光老化在盛水的照射盒上方放置UV照射儀，將大鼠置于盒中行游泳訓(xùn)練，同時(shí)予以UV照射。連續(xù)12周后建模成功，各治療組同期予以灌胃治療。觀察各組大鼠皮膚外觀，如圖1所示，對(duì)照組色澤正常，彈性良好；生理鹽水組大鼠背部照射區(qū)域，皮膚表現(xiàn)為進(jìn)行性彈性喪失，粗皺紋，伴有脫屑、結(jié)痂等嚴(yán)重皮損情況；鋅治療組、VitC治療組、VitC+鋅聯(lián)用組大鼠皮膚彈性較好，皮損等情況較生理鹽水組好轉(zhuǎn)，VitC+鋅聯(lián)用組皮損癥狀最輕，更接近對(duì)照組。病理切片檢測(cè)各組皮膚組織，如圖2所示，HE染色發(fā)現(xiàn)對(duì)照組皮膚表皮細(xì)胞排列整齊，表皮層和真皮層分界清楚；真皮層內(nèi)可見纖維組織，其排列有序，分布均勻；模型組表皮增厚，表皮結(jié)構(gòu)不完整，分層不清，真皮內(nèi)纖維發(fā)生變形、破壞，排列紊亂，分布稀疏，間有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鋅治療組、VitC治療組、VitC+鋅聯(lián)用組皮膚病理表現(xiàn)介于對(duì)照組和生理鹽水組之間，其中聯(lián)用組表皮層和真皮層分界較清晰，真皮內(nèi)纖維組織排列有序，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少。用masson法行I型膠原染色，如圖3所示，對(duì)照組皮膚內(nèi)有排列整齊的纖維組織，分布均勻，疏密有致，成分及數(shù)量適當(dāng)；生理鹽水組I型膠原表達(dá)成分最弱，纖維發(fā)生變性，伴有結(jié)構(gòu)破壞，真皮組織排列紊亂，分布不均或稀疏，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；鋅治療組、VitC治療組、VitC+鋅聯(lián)用組真皮內(nèi)I型膠原纖維排列較規(guī)則、斷裂少、排列較均勻，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，其中聯(lián)用組情況最好。皮膚外觀和病理檢測(cè)均表明VitC+鋅聯(lián)用可以有效防護(hù)紫外光長(zhǎng)期照射，預(yù)防光老化，維持皮膚穩(wěn)定。

圖1　各組大鼠經(jīng)紫外線照射后皮膚外觀圖

圖2　各組大鼠組織病理切片圖(HE ×200)

圖3　各組大鼠組織切片I型膠原染色(masson法染色 ×200)

表1　各組大鼠皮膚組織生化指標(biāo)比較±s)

組別nSOD活性(U/mL)HYP含量(μg/mg)MDA含量(nmol/mL)MMP1含量(μg/mL)MMP3含量(μg/mL)骨膜蛋白含量(μg/mL)空白對(duì)照組8131.24±25.360.689±0.1243.59±0.745.78±1.224.78±1.132.25±0.38生理鹽水組870.17±19.52a0.487±0.114a9.08±1.98a13.29±4.21a12.26±3.84a1.27±0.24a鋅組884.15±18.85b0.535±0.116b7.41±1.84b12.84±4.31b10.15±2.57b1.68±0.33bVitC組898.23±25.36b0.589±0.120b6.02±1.14b8.51±1.35b9.12±1.68b1.87±0.30bVitC+鋅組8116.11±24.17b0.641±0.118b5.10±1.25b6.68±1.29b7.18±1.57b2.11±0.31b注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與生理鹽水組比較,bP<0.05

2.2VitC和鋅聯(lián)用有效改善光老化大鼠的生化指標(biāo)取大鼠皮膚組織勻漿后檢測(cè)各組大鼠皮膚的生化指標(biāo)，見表1。采用羥胺法檢測(cè)SOD活性，生理鹽水組大鼠的SOD活性較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，經(jīng)鋅、VitC、VitC+鋅聯(lián)用治療各組的SOD活性均有升高；與生理鹽水組相比，聯(lián)用組升高效率最佳(P<0.05)。生理鹽水組大鼠皮膚的HYP含量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，經(jīng)鋅、VitC、VitC+鋅聯(lián)用治療各組的HYP含量均有升高；與生理鹽水組相比，聯(lián)用組HYP升高優(yōu)于鋅和VitC(P<0.05)。生理鹽水組大鼠皮膚的MDA含量較對(duì)照組顯著上升(P<0.05)，經(jīng)鋅、VitC、VitC+鋅聯(lián)用治療各組的MDA含量均有下降；與生理鹽水組相比，聯(lián)用組抑制MDA升高升高優(yōu)于鋅和VitC(P<0.05)。與對(duì)照組相比，光老化大鼠皮膚內(nèi)MMP1和MMP3含量顯著升高(P<0.05)，治療各組均可以抑制皮膚內(nèi)MMPs含量上升，其中聯(lián)用組效果優(yōu)于鋅和VitC(P<0.05)。光老化大鼠皮膚內(nèi)骨膜蛋白含量較對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，治療各組均可以促進(jìn)骨膜蛋白表達(dá)，聯(lián)用組效果優(yōu)于鋅和VitC(P<0.05)。

3　討　論

海上長(zhǎng)周期接受中低劑量紫外線照射會(huì)導(dǎo)致多種不可逆的慢性光曬傷。光老化就是慢性光曬傷的一種，不僅出現(xiàn)皮膚變薄、彈性下降、色素不均、毛細(xì)血管擴(kuò)張等皮損，還可能出現(xiàn)惡變[6-8]。是否可以在此發(fā)生之前進(jìn)行干預(yù)，最大限度地延緩這一過程呢？本實(shí)驗(yàn)以此為研究目的，結(jié)合國內(nèi)外研究[9]和自身實(shí)踐建立游泳訓(xùn)練大鼠光老化的模型，在盛水的照射盒上方安置UV燈，在訓(xùn)練大鼠游泳的同時(shí)予以中劑量紫外照射，希望有效模擬海訓(xùn)時(shí)的太陽照射情況。既往研究顯示，中波紫外線(UVB 290～320 nm) 照射可產(chǎn)生紅斑、DNA損傷和皮膚癌，故認(rèn)為UVB 可損傷結(jié)締織，產(chǎn)生光老化。近年研究表明，長(zhǎng)波紫外線(UVA 320～400 nm)也與皮膚光老化關(guān)系密切，UVA可擴(kuò)大或協(xié)同UVB的光老化作用。另有研究顯示，紫外線照射后皮膚組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧簇(reactive oxidative species，ROS)含量升高可導(dǎo)致皮膚光老化[10]。據(jù)此，我們選擇UVB聯(lián)合UVA照射，建立SD大鼠紫外光輻照動(dòng)物皮膚老化模型。

Vit C是人體所必需的維生素之一，也是皮膚科常用藥物。它為水溶性維生素，是皮膚的重要組成部分，在表皮和真皮中都有較高的表達(dá)[11-12],參與膠原蛋白和組織細(xì)胞間質(zhì)的合成，參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，具有抗氧自由基及對(duì)DNA 損傷有保護(hù)作用。年齡的增長(zhǎng)、紫外線照射以及環(huán)境污染等因素均可以造成在皮膚組織中Vit C含量的減少。皮膚中的角質(zhì)形成細(xì)胞在Vit C 的轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用[13]?？诜a(bǔ)充Vit C可以提高其在皮膚組織中的含量[14]。已有研究顯示Vit C單獨(dú)或與其他藥物如Vit E等聯(lián)合應(yīng)用中均具有抗氧化，保護(hù)DNA，改善成纖維細(xì)胞功能的作用[15]。鋅是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是300多種酶的組成成分，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、有著不可替代的重要作用。機(jī)體6%左右的鋅存在于皮膚[16]。它是許多金屬酶的活性輔助因子，在細(xì)胞的分化過程中起到重要作用。已有研究顯示顯示，鋅具有促進(jìn)傷口愈合的作用[17]。因此我們選擇Vit C與鋅聯(lián)合使用，探索其對(duì)光老化的防護(hù)作用與機(jī)制。

照射后本文發(fā)現(xiàn)：大鼠皮膚進(jìn)行性彈性喪失，皺紋變粗，伴有脫屑等現(xiàn)象，病理切片顯示表皮增厚，表皮結(jié)構(gòu)不完整，分層不清，真皮纖維發(fā)生變形、破壞，排列紊亂，分布稀疏，有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。I型膠原表達(dá)成分減少，纖維發(fā)生變性，伴有結(jié)構(gòu)破壞，真皮組織排列紊亂，分布不均或稀疏等。這些都符合皮膚受紫外線照射后光老化的現(xiàn)象，說明建模成功。本文采用Vit C和鋅口服制劑作為治療劑，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組大鼠皮膚外觀較好，紅斑、脫屑等皮損較輕，表皮結(jié)構(gòu)較完整，分界清晰，真皮內(nèi)纖維排列較整齊，I型膠原結(jié)構(gòu)完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，顯示兩者聯(lián)用維持皮膚結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)穩(wěn)定，具有良好的抗光老化作用。

已有研究顯示，紫外線照射可誘導(dǎo)人類皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，MMPs能特異性降解絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)成分，在皮膚光老化中起著重要作用[18-19]。而且MMPs能降解前膠原Ⅰ和Ⅲ，使皮膚在紫外線損傷后膠原修復(fù)能力下降。有研究表明中性粒細(xì)胞通過浸潤(rùn)后分泌彈性蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶參與了皮膚光老化的過程。骨膜蛋白是一種胞外基質(zhì)分泌性蛋白，新近研究顯示，骨膜蛋白在膠原蛋白生成及動(dòng)態(tài)平衡的維持中發(fā)揮了重要作用。在紫外光所致的皮膚老化動(dòng)物模型中骨膜蛋白表達(dá)明顯減少[20]。紫外線照射會(huì)造成皮膚組織SOD活性顯著下降[21]，HYP含量下降[22]及MDA含量增加[23]，可造成皮膚光老化。皮膚中最豐富的膠原類型是Ⅰ型、Ⅲ型膠原，羥脯氨酸是真皮內(nèi)含量較高且相對(duì)穩(wěn)定的氨基酸，為膠原蛋白特有的氨基酸之一，其含量可以間接反映出真皮內(nèi)膠原蛋白含量的變化，而膠原含量的變化可以提示皮膚的衰老程度[24-25]。故可作為判定皮膚衰老程度的一個(gè)特殊而敏感的指標(biāo)。SOD是一種生物活性蛋白，是共認(rèn)最有效的抗氧化劑和自由基清除劑，具有保護(hù)細(xì)胞活性的能力[26]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈終止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物，其含量可以間接反映自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體組織細(xì)胞的過氧化程度。

本文發(fā)現(xiàn)，鋅、 Vit C制劑和Vit C+鋅治療大鼠后，皮膚表皮、真皮組織結(jié)構(gòu)完整性、維持I型膠原較未用藥組更加穩(wěn)定。相比于模型組，尤以Vit C+鋅聯(lián)合用藥組可以更有效抑制皮膚內(nèi)金屬蛋白酶MMP1和MMP3的升高，提升組織內(nèi)骨膜蛋白HYP含量，促進(jìn)SOD活性，抑制MDA表達(dá)。這些都說明：Vit C+鋅制劑可以有效保護(hù)皮膚，抑制紫外線引起的皮膚的光老化現(xiàn)象。Vit C和鋅聯(lián)用能夠發(fā)揮良好的協(xié)同效應(yīng)，且優(yōu)于同劑量的Vit C和鋅單獨(dú)使用，Vit C和鋅相互促進(jìn)、協(xié)調(diào)的作用機(jī)制和其間的信號(hào)傳遞通路仍然值得我們深入探索。

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(本文編輯：張仲書；英文編輯：王建東)

Synergistic effect of Vitamin C and Zn on anti-skin photoaging ability of swimming trainingrat

ZHANG Yi1, GUO Zhi-li2, ZHANG Yong2.

1.DepartmentofImmunology, 2.DepartmentofDermatology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the simple and effective protection method on skin photoaging of swimming training rat. MethodsSwimming training rats were irradiated by ultraviolet-radiation over long-term and treated with VitC and Zinc. The skin of rats was collected to assess the changes of skin pathology, investigate the contents of HYP and MDA, the activity of SOD, and determine the contents of MMPs and periosteum protein by ELISA assay. ResultsSwimming training rat ultraviolet-radiation-induced photoaging model was established. The intervention of VitC and Zn on rat could maintain the integrity of skin tissue, preserve the stability of type I collagen, increase the contents of skin HYP and the activity of SOD, inhibit the expression of MDA and MMPs, and promote the expression of periosteum protein. ConclusionVitC combined with Zinc could effectively protect skin from photoaging of swimming training rat.

Vitamin C; Zn; ultraviolet; skin photoaging; synergistic effect

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81101210)

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)，1. 免疫學(xué)教研室，2. 長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科

引用格式：張意，郭志麗，張勇.VitC和鋅對(duì)游泳訓(xùn)練大鼠皮膚光老化的協(xié)同防護(hù)作用[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(4):337-340,390.

R994.6

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.04.001

2016-05-24；

2016-06-01)