奧美沙坦對心肌肥厚大鼠炎癥因子表達(dá)的影響*

師振霞　翟冬枝　師悅天　周向東　邵磊　胡衛(wèi)軍　李萍

(1.河南工程學(xué)院校醫(yī)院普通內(nèi)科, 河南 鄭州 450000;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科, 河南 鄭州 450000;3.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058;4.河南胸科醫(yī)院心內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

?

·論著·

奧美沙坦對心肌肥厚大鼠炎癥因子表達(dá)的影響*

師振霞1翟冬枝2師悅天3周向東4邵磊2胡衛(wèi)軍1李萍1

(1.河南工程學(xué)院校醫(yī)院普通內(nèi)科, 河南 鄭州 450000;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射科, 河南 鄭州 450000;3.浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310058;4.河南胸科醫(yī)院心內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

目的探討奧美沙坦對大鼠模型肥厚心肌中TNF-α、MMP-3、CRP的表達(dá)及心肌重塑的影響。 方法60只健康清潔2級雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組三組；模型組和干預(yù)組大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素0.02 mg/(kg·d)，bid；對照組大鼠背部皮下注射1 mL生理鹽水,bid；應(yīng)用10天。10天后干預(yù)組用奧美沙坦10 mg/(kg·d) 灌胃，qd，其余兩組用1 mL蒸餾水灌胃qd；8周后測定大鼠心肌組織中TNF-α、MMP3、CRP的表達(dá)，HE染色比較大鼠心肌纖維化程度。 結(jié)果模型組和干預(yù)組心肌纖維化程度明顯高于對照組，干預(yù)組顯著低于模型組(P<0.05)；與心肌組織TNF-α、MMP-3、CRP的水平一致。 結(jié)論 應(yīng)用奧美沙坦可以降低心肌肥厚大鼠心肌組織中TNF-α、MMPs、CRP水平，降低多種炎性因子對機(jī)體的危害作用,抑制或延緩心力衰竭的發(fā)生。

異丙腎上腺素；腫瘤壞死因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；C反應(yīng)蛋白；奧美沙坦

再灌注技術(shù)減少了急性心肌梗死患者的死亡率，心肌損傷后臟器和組織代償以及高血壓、冠心病、動脈硬化及糖尿病等誘發(fā)的慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)的發(fā)生率、死亡率呈上升趨勢。心肌重構(gòu)-心室重塑是心肌損傷的基本反應(yīng)。心肌重塑造成心肌肥厚，心腔擴(kuò)大，心臟順應(yīng)性降低，最終導(dǎo)致心肌衰竭。當(dāng)前心血管臨床及科研的重要問題之一就是解決心肌重塑對人體機(jī)能的不利影響。心室重塑時，機(jī)體發(fā)生一系列的神經(jīng)體液改變：腎素--血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感--腎上腺素能系統(tǒng)活性增高，大量炎性細(xì)胞因子異常釋放。研究表明，腫瘤壞死因子-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α)、 C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metal loproteinase, MMP3)以及其他基因蛋白如血清MMP-10、DPT、MLZE、LTBP-2、IGF-IIR及TSC-22水平的變化趨勢與心衰發(fā)展不同階段相一致[1]。研究這些反應(yīng)的機(jī)理，尋找調(diào)節(jié)這些異常使其恢復(fù)正常水平的藥物成為目前治療相應(yīng)種類疾病的有效途徑之一。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β受體阻滯劑分別通過阻斷RAS及交感神經(jīng)系統(tǒng)(SAS)延緩甚至逆轉(zhuǎn)心室重塑已得到證實(shí)和公認(rèn)[2]。臨床上把抑制CHF患者體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活作為治療的關(guān)鍵[3]。具有抗炎作用的藥物是否能夠通過抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)逆轉(zhuǎn)心室重塑，國內(nèi)外已經(jīng)展開研究[4]；他汀類降脂藥通過其抗炎作用逆轉(zhuǎn)心室重塑的研究已大量展開。奧美沙坦治療心衰的作用是否與影響TNF-α、MMPs、CRP表達(dá)有關(guān)，目前國內(nèi)外研究較少。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用異丙腎上腺素作用于Wistar大鼠建立心肌肥厚模型，用奧美沙坦灌胃干預(yù)，系統(tǒng)研究TNF-α、MMP3、CRP三種炎性因子的表達(dá)水平及其與藥物的相關(guān)性，并和對照組比較，探討奧美沙坦對心肌重塑的干預(yù)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)將60只健康清潔2級Wistar雄性大鼠[體重(200±50) g]分為對照組、模型組、干預(yù)組。用異丙腎上腺素作用于模型組(20只)和干預(yù)組(20只)建立高血壓心肌肥厚模型，10天后模型建立成功，模型組(18只)和干預(yù)組(16只)在建模過程中分別死亡2只和4只。

1.2藥物干預(yù)①對照組每日大鼠背部皮下注射生理鹽水1 mL/d，bid；模型組和干預(yù)組相同部位皮下注射異丙腎上腺素0.02 mg/(kg·d)，bid，連續(xù)注射10天。②10天后干預(yù)組大鼠用奧美沙坦10 mg/(kg·d)+蒸餾水1ml灌胃，qd，其余大鼠予蒸餾水(1 mL)灌胃，共8周《奧美沙坦酯，第一三共(上海)制藥有限公司，規(guī)格：20 mg/片》。大鼠灌胃液中含坎地沙坦2 mg/(kg·d)， 其余組灌胃液中無藥物組分。③灌注時間4周。

1.3用免疫組化法測心肌中TNF-α、MMP3、CRP的表達(dá)第一抗體稀釋效價(jià)為1∶96，加一抗后，切片置于濕盒內(nèi)4℃冰箱過夜，陰性對照不加一抗，加正常血清。加入二抗(SP-9000 生物素化標(biāo)記兔抗鼠IgG)，稀釋效價(jià)為1∶148，37 ℃濕盒30 min。辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈球菌卵白素稀釋效價(jià)為1∶148，37 ℃濕盒30 min。 每次加抗體前均以PBS振蕩漂洗5 min，3次，DAB、明及樹膠封片后，以光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4HE染色比較大鼠心肌纖維化程度

2　結(jié)果

2.1三組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重比較標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)8周后，三組大鼠麻醉后分組用天平稱重，比較體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　三組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重比較( ±s,g)

注：比較三組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)

2.2三組大鼠心肌組織中TNF-α、MMP3、CRP的表達(dá)比較8周后,取出大鼠心臟，免疫組化法測大鼠心尖部心非梗死區(qū)心肌組織中TNF-α、MMP3、CRP的表達(dá)，并與對照組相比，模型和干預(yù)組上述指標(biāo)含量明顯增高(P<0.05)，而干預(yù)組上述指標(biāo)均明顯低于模型組(P<0.05)，見表2。

Table 2Comparison of TNF-α, MMP3 and CRP in myocardiai tissues of ras among the three groups

組別nTNF-α(平均灰度值)MMP3(平均灰度值)CRP(平均灰度值)干預(yù)組18127.6±8.5108.9±9.6289.6±41.3模型組16149.1±5.3137.4±12.5351.9±33.7對照組2095.4±7.689.1±13.8326.5±43.2

注：三組大鼠左室心肌組織中TNF-α、MMP3、CRP的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型和干預(yù)組上述指標(biāo)含量明顯增高(P<0.05)，而干預(yù)組上述指標(biāo)均明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3免疫組化檢測TNF-α、MMP3和CRP對比

2.3.18周后，取出大鼠心臟，免疫組化法測大鼠心尖部非梗死區(qū)心肌組織中TNF-α的表達(dá)，模型和干預(yù)組TNF-α含量明顯增高,干預(yù)組該指標(biāo)含量明顯低于模型組。見圖1(圖中著色重的部分顯示平均灰度高)。

2.3.28周后,取出大鼠心臟，免疫組化法測大鼠心尖部非梗死區(qū)心肌組織中MMP3的表達(dá)，模型和干預(yù)組MMP3含量明顯增高,干預(yù)組該指標(biāo)含量明顯低于模型組。見圖2(圖中著色重的部分顯示平均灰度高)。

2.3.38周后,取出大鼠心臟，免疫組化法測大鼠心尖部非梗死區(qū)心肌組織中CRP的表達(dá)，模型和干預(yù)組CRP含量明顯增高,干預(yù)組該指標(biāo)含量明顯低于模型組。見圖3(圖中著色重的部分顯示平均灰度高)。

2.4HE染色對比8周后,取出大鼠心臟，對大鼠心尖部非梗死區(qū)心肌組織進(jìn)行HE染色，可見對照組心肌細(xì)胞排列整齊，無間質(zhì)纖維化。模型組心肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維增生，間質(zhì)纖維化明顯，干預(yù)組較模型組心肌間質(zhì)纖維化減輕，見圖4。

圖1TNF-α在三組大鼠心肌組織中的表達(dá)(IHC×400)

Figure 1The expression of TNF-αin the three group

圖2MMP-3在三組大鼠心肌組織中的表達(dá)(IHC×400)

Figure 2The expression of TNF-αin the three group

圖3CRP 在三組大鼠心肌組織中的表達(dá)

Figure 3The expression of TNF-αin the three group

圖4HE染色比較大鼠心肌纖維化程度(IHC×400)

Figure 4The degree of fibrosis

3　討論

高血壓的病因和病理變化呈現(xiàn)多元化復(fù)雜化的特征。高血壓病造成相關(guān)靶器官損傷時急性時相反應(yīng)蛋白CRP在6～8 h即上升，24～48 h(又有48～72 h的報(bào)道)達(dá)到高峰；有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在冠狀事件及周圍血管病的各種高危因素中CRP是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其升高與病情發(fā)展密切相關(guān)。

高血壓病造成靶器官損傷及一系列神經(jīng)體液改變，心臟代償心肌重塑最后發(fā)展為失代償?shù)男牧λソ咴黾又職埡椭滤缆剩恍募≈厮苤饕±碜兓癁樾那粩U(kuò)大、細(xì)胞肥大而數(shù)量減少、心肌間質(zhì)纖維化，順應(yīng)性降低收縮舒張功能障礙，最終致心力衰竭甚至死亡[5]。心肌重塑的一系列分子生物學(xué)變化表現(xiàn)在RAAS和SAS活性的增高，大量炎性細(xì)胞因子如MMPs/CRP/TNF- α/內(nèi)皮因子等的異常分泌諸多方面。心肌重塑的多重影響因素中，RAAS系統(tǒng)的作用尤為重要。血管緊張素Ⅱ除直接刺激膠原蛋白沉積于心肌間質(zhì)，又間接借助一些炎性介質(zhì)如MMPs促進(jìn)心肌纖維化。由MMPS及其抑制因子(tissue inhibitor oe matrix metalloproteinases TIMPs)調(diào)控的細(xì)胞外基質(zhì)再生及水解的失衡,在心室重塑過程中作用突出，目前發(fā)現(xiàn)的MMPs系列因子有幾十種之多。研究表明重塑心肌組織中MMPs表達(dá)還受TNF-α等細(xì)胞因子調(diào)控；離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)TNF-α可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞MMPs蛋白表達(dá)上調(diào)及活化[6]。 TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，參與介導(dǎo)一些嚴(yán)重的病理生理過程。在一項(xiàng)針對老年高血壓患者的研究中，老年高血壓患者血清CRP和TNF-α水平明顯升高[7]。目前認(rèn)為炎癥和冠心病關(guān)系密切，冠心病也是一種炎癥性疾病[8]。TNF-α不僅參與了冠心病、動脈粥樣硬化、心肌炎、高血壓、心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展過程，而且在冠心病和高血壓所致的心力衰竭患者血漿中TNF-α水平隨著心功能不全的加重而逐漸增加，動物實(shí)驗(yàn)也己證實(shí)TNF-α等炎癥細(xì)胞因子在大鼠心肌梗死后的心肌細(xì)胞表達(dá)明顯升高，參與了梗死后心室重塑的過程[9]。TNF-α等會引起心肌細(xì)胞的壞死及啟動心肌細(xì)胞的調(diào)亡，近年研究也表明心肌細(xì)胞的調(diào)亡在心衰發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重大作用,而且心肌細(xì)胞的喪失是心衰走向失代償?shù)母驹騕10]；同時MMP-9和CRP水平隨著心力衰竭程度加重而升高，心力衰竭程度重者M(jìn)MP-9和CRP水平高于心力衰竭程度輕者；CHF患者血清MMP-9和CRP呈正相關(guān)[11]。

RAAS將血管緊張素原經(jīng)腎素水解形成血管緊張素Ⅰ，再經(jīng)轉(zhuǎn)換酶轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ，進(jìn)而作用心血管腎臟等組織器官并刺激醛固酮的合成與分泌，醛固酮促進(jìn)腎小管離子轉(zhuǎn)運(yùn)，水鈉潴留循環(huán)總?cè)萘吭黾樱苁湛s血壓增高，心臟前后負(fù)荷加大，心臟代償發(fā)生心室重構(gòu)。有研究顯示奧美沙坦通過調(diào)節(jié)大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶mRNA、降低血管緊張素Ⅱ活性,改善壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚[12]。奧美沙坦是奧美沙坦酯口服經(jīng)小腸壁去酯化后的活性成分，具有高度的選擇性，可以和AT1的2個位點(diǎn)結(jié)合，一個是-OH組，一個是∝-COOH組，即所謂的“雙鏈占領(lǐng)”，而ARB類的其他藥物只與AT1的-OH組結(jié)合[13]如坎地沙灘等。奧美沙坦的高度選擇性決定了其與AT1的高親和力和持久穩(wěn)定的降壓作用[14]。

大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示奧美沙坦除與AT1結(jié)合抑制血管緊張素Ⅱ活性降低血壓,尚有其他生物學(xué)作用：抗炎癥降低血清中TNF-α、 CRP、IL-6、 TGFβ-1等炎癥因子、消除自由基抗氧化、抗細(xì)胞凋亡等[15]。大鼠實(shí)驗(yàn)中,奧美沙坦可防止一氧化氮(NO)這種早期炎癥標(biāo)志物合成從而阻止其引起得心臟纖維化。在動脈硬化模型中,奧美沙坦可縮減主動脈(A)斑塊面積并降低其內(nèi)膜厚度，有研究顯示大的頸動脈斑塊(>33UL)在治療102周后明顯縮小[16].在EUTOPIA對有關(guān)實(shí)驗(yàn)的評估中揭示奧美沙坦對于血管的保護(hù)作用與降低血漿中骨橋蛋白濃度有關(guān)[17]；骨橋蛋白有促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼附于細(xì)胞外基質(zhì)上的功能[18]；糖尿病患者服用奧美沙坦后動脈硬化程度降低，而氨氯地平無此作用[19]；COACH有實(shí)驗(yàn)證實(shí)高血壓病人服用CCB類藥物(如氨氯地平等)出現(xiàn)外周性水腫概率在聯(lián)合使用奧美沙坦時有明顯降低：單用氨氯地平10 mg水腫發(fā)生概率(36.8%)顯著高于奧美沙坦/氨氯地平40 mg/10 mg(23.5%)聯(lián)合使用的發(fā)生率[20]；目前有多種試驗(yàn)顯示奧美沙坦是一種具有復(fù)雜的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)的ARB類藥物。

4　結(jié)論

奧美沙坦能降低心肌肥厚大鼠心肌組織中TNF-α、MMPs、CRP水平和多種炎性因子對機(jī)體的危害作用,具有抑制或延緩心力衰竭發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)。

[1]張芃. 心力衰竭相關(guān)的血清標(biāo)記物的初步篩選及與心室重構(gòu)相關(guān)性的研究[D]. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2010:11-12.

[2]Antelava N,Paehkoriia K,Kezeli T,etal.Major Pathogenic links of atheroselerosis[J]. Geogian Med News,2005,12(8):72-79.

[3]黃峻. 中國心力衰竭診斷和治療指南2014版[J]. 中國心血管病雜志，2014，42(2)：99-100.

[4]崔坤, 殷躍輝. ACE2-Ang(1-7)-Mas軸與心房顫動的關(guān)系[J]. 國際心血管病雜志,2011,38(3):152-154.

[5]李涵. MMP1及MMP3在心肌肥厚大鼠中的表達(dá)及奧美沙坦對其影響[J]. 中國老年學(xué)雜志,2013,22(6)：741.

[6]唐杰文. 老年性高血壓病患者血清hS-cRP及細(xì)胞因子檢測的臨床價(jià)值[J]. 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2007,18(6): 48-49.

[7]Lopez Salazar B,Ravassa Albeniz S,Arias Guedon T,etal. Altered fibrillar collagen metabolism in hypertensive heart failure. Current understanding and future prospects[J].Rev Esp Cardiol,2006,59(10):1047-1057.

[8]周向東, 張衛(wèi)國,李恩,等. 阿托伐他汀對大鼠心肌梗死后腫瘤壞死因子α丙二醛表達(dá)的影響[J]. 醫(yī)藥論壇雜志,2010,31(5):88-89.

[9]王先利. 硫化氫對大鼠心肌梗死后心力衰竭的保護(hù)作用及其可能機(jī)制探討[D]. 復(fù)旦大學(xué),2010:13.

[10] 朱海霞. 慢性心力衰竭患者血清白介素6、高敏C反應(yīng)蛋白和腫瘤壞死因子α水平的變化及臨床意義[J]. 中國全科醫(yī)學(xué),2011,14(10)：3362-3366.

[11] 徐雁. 慢性心力衰竭患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶和C-反應(yīng)蛋白的變化及藥物干預(yù)對影響[D].青島大學(xué),2007:9-10.

[12] 李倩曉,于勤.心肌肥厚的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,7(17):1945.

[13] Miura S,Fujino M,Hanzawa H,etal. Molecular mechanism un-derlying inverse agonist of angiotensinⅡtype 1 receptor[J]．JBiol Chem,2006,28(1):19288-19295.

[14] 郭冬華， 韓常寶. 奧美沙坦酯的臨床研究進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生,2012,40(11):26-28.

[15] Zhang H,Ma GS,Yao YY,etal. Olmesartan Attenuates the Impairment of Endothelial Cells Induced by Oxidized Low Density Lipoprotein through Downregulating Expression of LOX-1[J]. Int J Mol Sci,2012,13(2):1512-1523.

[16] Stumpe KO. Olmesartan compared with other angiotensin Ⅱ re-ceptor antagonists:head-to-head trials[J].Clin Ther,2004,26(Suppl A):33-37.

[17] Lorenzen JM,Neunhoffer H,David S,etal. Angiotensin Ⅱ re-ceptor blocker and statins lower elevated levels of osteopontin inessential hypertension results from the EUTOPIA trial[J]．Ather-osclerosis,2010,20(9):184-188.

[18] Oldberg A,Franzen A,Heinegard D.Cloning and sequence analysis of rat bone aialoprotein(ostenpontin) cDNA reveals an Arg-Gly-Aspcell-binding sequence[J].Prug Nail Acad Sci USA,1986,83(01)：8819.

[19] Miyashita Y,Saiki，Endo K,etal． Effects of olmesartan，an an-giotensin Ⅱ receptor blocker,and amlodipine,a calcium chan-nel blocker,on Cardio-Ankle Vascular Index (CAVI) in type 2diabetic patients with hypertension[J]． J Atheroscler Thromb,2009,16(13):621-626.

[20] Chrysant S,Melino M,Karki S,etal. The combination of olmesartan medoxomil and amlodipine besylate in controlling highblood pressure:COACH,a randomized ouble-blind lacebo-controlled,8-week factorial efficacy and safety study[J]． Clin T-her,2008,30(4):587-604.

Effects of olmesartan on inflammatory factor in cardiac hypertrophy rats

SHI Zhenxia1，ZHAI Dongzhi2，SHI Yuetian3, et al

(1.DepartmentofGeneralInternalMedicine,HospitalofHenanEngineeringCollege,Zhengzhou450000,China;2.DepartmentofRadiology,TheSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China;3.CollegeofBiomedicalEngineeringandInstrumentScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;4.DepartmentofCardiology,HennanChestHospital,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo observe the effects of olmesartan on tumor necrosis factor-α(TNF-α),metalloproteinases-3(MMP-3),C-reaction protein(CRP) in cardiac hypertrophy rat. Methods60 Wistar rats were randomly divided into control group and isoprenaline group. When established as the model, the rats of isoprenaline group were randomly divided into model group and intervention group. Based on standard feeding, the control group was treated with subcutaneous injection of 1ml saline b.i.d.. The model group and intervention group were treated with subcutaneous injection of 0.02mg/kg/d isoproterenol b.i.d.. Then, the intervention group was treated with olmesartan. The rats were killed eight weeks after intragastric administration. TNF-α, MMP-3, CRP, concentration levels, degree of fibrosis in rats were observed. ResultsThe degree of fibrosis in model group and intervention group were significantly higher than that in control group. The degree of fibrosis, TNF-α, MMP-3 and CRP in intervention group were significantly lower than that model group(P<0.05). Conclusion Olmesartan can decrease the degree of myocardial fibrosis and improve the remodeling and cardiac function after cardiac hypertrophy.

Cardiac hypertrophy; TNF-α; MMPs; CRP; Olmesartan

河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(142300410010)

周向東，E-mail:ccz1992ccz@126.com

R 542.2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.006

2015-11-10； 編輯： 張文秀)