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    紅花注射液生物活性測(cè)定方法的建立與質(zhì)量評(píng)價(jià)

    2016-09-16 09:17:30馮五文李瑞煜董芹章從恩李光全史志龍董小萍
    中藥與臨床 2016年3期
    關(guān)鍵詞:抗凝血酶凝血酶效價(jià)

    馮五文,李瑞煜,董芹,章從恩,李光全,史志龍,董小萍

    ·炮制制劑·

    紅花注射液生物活性測(cè)定方法的建立與質(zhì)量評(píng)價(jià)

    馮五文,李瑞煜,董芹,章從恩,李光全,史志龍,董小萍

    目的:建立基于生物活性測(cè)定的紅花注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,探究紅花注射液不良反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法:建立挑絲法測(cè)定不同批次的紅花注射液對(duì)凝血酶的抑制作用;采用紫外分光光度法測(cè)定不同批次紅花注射液中總黃酮;采用相關(guān)分析考察抗凝血酶效價(jià)與總黃酮之間的相關(guān)性。結(jié)果:部分不良反應(yīng)批次的紅花注射液抗凝血酶活性比正常批次強(qiáng);抗凝血酶活性與總黃酮含量有顯著相關(guān)。結(jié)論:所建立的基于抗凝血酶活性的紅花注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)方法重復(fù)性好,靈敏簡(jiǎn)便,可作為現(xiàn)行紅花注射液質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充方法;紅花注射液的不良反應(yīng)與總黃酮含量有關(guān),總黃酮含量過(guò)高為部分紅花注射液引起不良反應(yīng)的原因。

    紅花注射液;生物活性測(cè)定;凝血酶;不良反應(yīng);紫外分光光度法

    紅花注射液是由菊科植物中藥紅花(Carthanus tinctorius L.)經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝制成的中藥注射劑,具有抗凝血、抑制血栓形成、降血壓等作用,臨床主要用于心腦血管性疾病,如冠心病、心絞痛、肺心病心力衰竭、腦梗死等。盡管在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用和藥理效應(yīng)的肯定,然而臨床上關(guān)于紅花注射液不良反應(yīng)的報(bào)道卻呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。2012年,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《藥品不良反應(yīng)信息通報(bào)》(第52期)通報(bào)警惕紅花注射液的不良反應(yīng),紅花注射液引發(fā)不良反應(yīng)的問(wèn)題已經(jīng)成為關(guān)乎人民群眾安全的亟需解決的問(wèn)題。

    中藥注射劑的質(zhì)量與不良反應(yīng)的發(fā)生有著密切的關(guān)系,如何有效控制紅花注射液的質(zhì)量已經(jīng)成為當(dāng)前的一個(gè)重要的挑戰(zhàn)。紅花的藥材來(lái)源相對(duì)廣泛,制備工藝復(fù)雜,活性成分多,導(dǎo)致目前廣泛采用的監(jiān)測(cè)少數(shù)常規(guī)化學(xué)成分的含量測(cè)定或指紋圖譜的方法不能很好的控制紅花注射液質(zhì)量和臨床療效,因此,建立新方法以對(duì)紅花注射液的質(zhì)量進(jìn)行補(bǔ)充控制具有十分重要的意義。按照2010版《中國(guó)藥典》中的《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》,本文建立了基于抗凝血酶作用的紅花注射液質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,該方法靈敏簡(jiǎn)便,可作為現(xiàn)行紅花注射液質(zhì)量控制的補(bǔ)充控制方法。

    1 材料

    凝血酶(sigma:T4648,批號(hào):20130805229),纖維蛋白原(sigma:F8630,批號(hào):01401015266),生理鹽水(石家莊四藥有限公司,批號(hào):1408023203),山奈酚(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110861-200405);亞硝酸鈉、氫氧化鈉為分析純;紫外分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司);恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司);紅花注射液由四川雅安三九藥業(yè)有限公司等提供。

    2 方法

    2.1溶液的配制

    取纖維蛋白原粉末適量,溶解于37℃保溫的生理鹽水中,制成最終濃度為0.5%(凝固物計(jì))的纖維蛋白原溶液。取適量凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品,以生理鹽水溶解并定量稀釋配制成5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取紅花注射液,用生理鹽水按一定體積比將紅花注射液稀釋成原溶液的1/2、1/3、1/4、1/5、1/8、1/10濃度。

    2.2凝固時(shí)間檢測(cè)

    取96孔板,固定于37℃恒溫水浴中,同時(shí)避免水浴鍋中水進(jìn)入96孔板。用排搶每孔加入纖維蛋白原溶液100 μL,并每孔加入稀釋或未稀釋的紅花注射液50 μL,攪拌,孵育一定時(shí)間后,加入凝血酶溶液10 μL,攪拌混勻,用排槍槍頭反復(fù)接觸溶液液面,記錄每孔從攪拌混勻到能從溶液中拉出細(xì)絲的時(shí)間(成絲時(shí)間)。采用生理鹽水作空白對(duì)照,記錄空白對(duì)照的成絲時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)8孔,求成絲時(shí)間平均值(最大值與最小值的差不得超過(guò)平均值的10%,如果超過(guò)則舍棄該值)。

    2.3總黃酮含量測(cè)定

    參照文獻(xiàn)[1],采用紫外分光光度法測(cè)定不同批次紅花注射液中總黃酮Y的含量。吸光度X與總黃酮含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 0. 0863 X + 0. 1072,r2=0.9942。

    2.4紅花注射液抗凝血酶的效價(jià)計(jì)算

    設(shè)凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)為U1,加入紅花注射液后實(shí)際測(cè)得的凝血酶效價(jià)為U2,則紅花注射液抗凝血酶的效價(jià)U計(jì)為U= U1- U2。

    2.5相關(guān)性分析

    采用SPSS 20.0 對(duì)紅花注射液中總黃酮和抗凝血酶效價(jià)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

    3 結(jié)果

    3.1凝血酶加入量考察

    凝血酶的加入量對(duì)成絲時(shí)間的長(zhǎng)短具有重要影響,為保證實(shí)驗(yàn)操作的方便性與省時(shí)性,成絲時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短。分別考察了5、10、20、30 μL的凝血酶加入量,發(fā)現(xiàn)加入5.0-10.0 U·mL-1的凝血酶10 μL時(shí),成絲時(shí)間在60 s至180 s之間,適合實(shí)驗(yàn)有序操作,故選擇凝血酶的加入量為10 μL。

    3.2紅花注射液稀釋度考察

    取不同稀釋度的紅花注射液,按2.2項(xiàng)下凝固時(shí)間檢測(cè)法檢測(cè),記錄加入不同稀釋度的紅花注射液后溶液的成絲時(shí)間。結(jié)果表明,當(dāng)稀釋至原溶液的1/3濃度時(shí),溶液成絲時(shí)間為100 s左右,適合實(shí)驗(yàn)操作,故選擇1/3濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

    3.3孵育時(shí)間考察

    考察了0、5、10、20、30 min作為纖維蛋白原溶液與紅花注射液的孵育時(shí)間,結(jié)果表明,孵育時(shí)間對(duì)成絲時(shí)間及成絲能力等無(wú)明顯影響,故選擇0 min為孵育時(shí)間。

    3.4方法學(xué)考察

    3.4.1線性關(guān)系考察 取5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按2.2項(xiàng)下凝固時(shí)間檢測(cè)法檢測(cè),記錄溶液成絲時(shí)間。以標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)的對(duì)數(shù)(X)為橫坐標(biāo),平均成絲時(shí)間的對(duì)數(shù)(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)行直線回歸,得效價(jià)與平均成絲時(shí)間的對(duì)數(shù)的回歸方程為Y= -0.9205 X + 2.8942,r2=0.9932。

    3.4.2精密度試驗(yàn) 取10.0 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按2.2項(xiàng)下方法連續(xù)6次測(cè)定溶液成絲時(shí)間,記錄每次測(cè)定的平均成絲時(shí)間,計(jì)算得平均成絲時(shí)間的RSD為4.7%。

    3.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取10.0 U·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,在纖維蛋白原溶液配制完成的0、1、2、4、8 h時(shí)按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行平均成絲時(shí)間的測(cè)定。同法考察凝血酶溶液在配制、紅花注射液在開封0、1、2、4、8、12 h時(shí)使用的平均成絲時(shí)間。結(jié)果表明,纖維蛋白原溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定,凝血酶和紅花注射液在開封12 h內(nèi)基本穩(wěn)定,因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在纖維蛋白原溶液配制的8 h內(nèi)進(jìn)行。

    3.4.4中間精密度試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)下方法,考察不同實(shí)驗(yàn)人員對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,計(jì)算得不同人員測(cè)定的平均成絲時(shí)間的RSD為4.8%。說(shuō)明不同實(shí)驗(yàn)人員對(duì)方法的結(jié)果影響較小,方法的穩(wěn)定性較好。

    3.5不同批次紅花注射液抗凝血酶效價(jià)及總黃酮的測(cè)定

    在確定方法學(xué)的可靠性后,測(cè)定不同廠家、不同批次的紅花注射液的抗凝血酶的效價(jià)以及其中的總黃酮含量,結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明,不良反應(yīng)批次間的紅花注射液抗凝血酶效價(jià)及總黃酮含量具有較大差異性,而正常批次的紅花注射液的抗凝血酶效價(jià)及總黃酮含量的差異較小。

    3.6紅花注射液抗凝血酶活性與化學(xué)成分間的相關(guān)性

    將所有批次的紅花注射液抗凝血酶效價(jià)與對(duì)應(yīng)的總黃酮含量作圖,見(jiàn)圖1。并按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)性系數(shù)0.898。結(jié)果表明,紅花注射液的抗凝血酶效價(jià)與總黃酮含量之間有顯著相關(guān)性。

    圖1 紅花注射液總黃酮含量與抗凝血酶效價(jià)的相關(guān)性分析

    4 討論

    目前,生物評(píng)價(jià)為中藥質(zhì)量控制的發(fā)展方向[2-3],這以《中國(guó)藥典》2010版附錄《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》為明確的信號(hào)標(biāo)志。因此,本文從生物評(píng)價(jià)角度研究紅花注射液的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。目前,活血化瘀類中藥一般從以下方法進(jìn)行生物活性測(cè)定研究[4]:①家兔/大鼠離體動(dòng)脈環(huán)(條)收縮試驗(yàn);②血小板聚集試驗(yàn);③凝血時(shí)間的測(cè)定,如活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)等;④大鼠動(dòng)脈血栓形成時(shí)間。鑒于上述方法均需要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與一般實(shí)驗(yàn)室不能配備的實(shí)驗(yàn)儀器,同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響因素多,本文嘗試采用體外(非動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)對(duì)紅花注射液進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)采用的凝血酶是體內(nèi)凝血、血栓形成過(guò)程的關(guān)鍵酶,在腦梗死等心血管疾病過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。紅花注射液中的主要成分為黃酮類及黃酮類色素類成分[5],文獻(xiàn)報(bào)道,黃酮類成分包括紅花注射液中的槲皮素具有抗凝血酶的作用[6-7]。因此,本文采用紅花注射液抗凝血酶活性評(píng)價(jià)紅花注射液質(zhì)量。

    關(guān)于凝血酶活性測(cè)試的方法有很多,比如發(fā)色底物法等,但這些方法所需材料昂貴。參考《中國(guó)藥典》2010版第二部凝血酶的質(zhì)量控制方法,本文做了改進(jìn),使所需的實(shí)驗(yàn)材料更少,實(shí)驗(yàn)耗時(shí)更少,實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度更高,所建立的方法穩(wěn)定、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便,所采用的紫外分光光度儀也為實(shí)驗(yàn)室配置的常規(guī)儀器,該方法用于紅花注射液的質(zhì)量控制時(shí)具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。同時(shí),所建立的方法對(duì)改進(jìn)《中國(guó)藥典》中一部水蛭和二部凝血酶的質(zhì)量控制均具有參考借鑒意義。

    為更好地與臨床結(jié)果相結(jié)合,比較了8批有不良反應(yīng)的樣品與10批正常樣品。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,10批正常樣品的總黃酮含量波動(dòng)相對(duì)較小,而8批不良反應(yīng)樣品的總黃酮含量相對(duì)波動(dòng)較大。其中,有5批不良反應(yīng)樣品的總黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常樣品的總黃酮含量,與文獻(xiàn)[8]等報(bào)道紅花注射液中成分含量波動(dòng)大相一致。據(jù)報(bào)道,紅花注射液的不良反應(yīng)的表現(xiàn)之一為出血[9],與西藥肝素、華華林等抗凝藥具有一致性,同時(shí),肝素等凝血酶抑制劑的主要不良反應(yīng)表現(xiàn)也為出血等癥狀,而且與用藥劑量有關(guān)[10~11],提示紅花注射液的不良反應(yīng)有部分是由于活性成分過(guò)多引起。5批不良反應(yīng)樣品的總黃酮含量較高,提示這些批次的不良反應(yīng)主要是由于其中有效成分含量過(guò)高、對(duì)凝血酶抑制作用過(guò)強(qiáng),這種原因符合文獻(xiàn)[12]的推測(cè)原因及活血化瘀藥“中病即止”的原理。目前,紅花注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了總黃酮的含量下限,但未規(guī)定含量上線,導(dǎo)致藥品生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品有效成分過(guò)多,出現(xiàn)不良反應(yīng)。因此,同有毒類中藥附子、馬錢子等一樣,我們建議《中國(guó)藥典》增加紅花注射液中的總黃酮含量上限。同時(shí),本文結(jié)果對(duì)其它的活血化瘀類中藥注射劑如丹紅注射液等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定也具有參考價(jià)值。

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    [4] 陳廣云,吳啟南,王新勝,等. 生物效價(jià)測(cè)定法用于活血化瘀中藥三棱品質(zhì)評(píng)價(jià)的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志,2012,37(19):2913.

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    (責(zé)任編輯:陳思敏)

    Bioactivity detection method development and quality evaluation of safflower injection/

    FENG Wu-wen, LI Rui-yu,DONG Qin, ZHANG Cong-en, LI Guang-quan, SHI Zhi-long, DONG Xiao-ping//( Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

    Objective: To establish a bioassay method to evaluate the quality of safflower injection and to explore the constituents related to adverse reaction of safflower injection. Method: With fibrinogen as enzyme substrate, safflower injection as enzyme inhibitor, thrombin as work enzyme, the abilities of different batches of safflower injection in inhibiting the thrombin were determined. The total flavonoids were determined by ultraviolet spectrophotometry. The correlation between antithrombase potency and total flavonoids were analyzed.Result: There were significant difference in the inhibit ability of different batches of safflower injection. Some abnormal samples showed stronger inhibit ability than normal samples. Correlation analysis indicated that there were strong correlation between inhibit ability of safflower injection and total flavonoids. Conclusion: The method established possesses the characteristics of good reproducibility, high sensitivity, simplicity and convenience, and can serve as a supplementary method to control the quality of safflower injection. The adverse reaction of safflower injection is related to total flavonoids content. High content of total flavonoids is a part of the reasons for adverse reaction of safflower injection.

    Safflower injection; bioassay; thrombin; adverse reaction; ultraviolet spectrophotometry

    ·藥理毒理·

    R 283

    A

    1674-926X(2016)03-013-03

    成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 611137

    馮五文,在讀碩士研究生,主要從事中藥有效成分及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 Email:jiaoxiake-1@foxmail.com

    董小萍,教授,主要從事中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與成分分析研究 Email:dongxiaoping11@126.com

    2015-08-02

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