穴位貼敷對哮喘大鼠嗜酸粒細(xì)胞及肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響

喬 明， 楊正明， 黃 謙， 劉蘭英（.連云港市中醫(yī)院， 連云港000； .江蘇省中醫(yī)院， 南京 0000）

穴位貼敷對哮喘大鼠嗜酸粒細(xì)胞及肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響

喬 明1， 楊正明1， 黃 謙1， 劉蘭英2
（1.連云港市中醫(yī)院， 連云港222000； 2.江蘇省中醫(yī)院， 南京 210000）

目的 觀察穴位貼敷對哮喘大鼠嗜酸粒細(xì)胞及肺組織超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 參考Palmans方法建立哮喘大鼠模型，觀察予穴位貼敷治療后大鼠全血白細(xì)胞數(shù)量和嗜酸粒細(xì)胞值以及肺組織超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果 模型組大鼠全血白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞較正常組明顯增加，各治療組大鼠全血白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞較模型組明顯減少。穴位貼敷可有效改善哮喘大鼠肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。結(jié)論 穴位貼敷可以減少大鼠全血白細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量，減輕哮喘大鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤及肺泡上皮細(xì)胞壞死，從而發(fā)揮治療哮喘的作用。

穴位貼敷； 哮喘； 嗜酸粒細(xì)胞； 肺組織； 超微結(jié)構(gòu)； 電子顯微鏡

哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分（cellular elements）參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。激素治療是最有效的控制氣道炎癥的方法之一，但其長期使用會出現(xiàn)激素依賴與抵抗現(xiàn)象，導(dǎo)致病情易反復(fù)發(fā)作，患者依從性較差。

穴位貼敷是中醫(yī)外治法之一，它依據(jù)冬病夏治理論，在三伏天穴位貼敷治療支氣管哮喘可減輕該病復(fù)發(fā)程度及次數(shù)。穴位貼敷治療哮喘簡便易行，療效明確，但是作用的機制尚不明確。為研究穴位貼敷治療哮喘的作用機制，作者建立了大鼠哮喘模型。觀察穴位貼敷對哮喘大鼠肺組織上皮細(xì)胞及血液中白細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 周齡SPF級雄性Wistar大鼠32只，上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供［SCXK（滬）2013-0016］， 隨機分成4組，分別為正常組（A）、模型組（B）、地塞米松組（C）、穴位貼敷組（D）， 每組8只。

1.2 儀器

魚躍402A型超聲霧化器， 江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司； 自制非完全密閉箱（30 cm×40 cm×50 cm）； JEM1200型射電鏡， 日本電子； Coulter LH750型全自動血液分析儀， 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試劑

卵蛋白（OVA）： 美國Sigma公司生產(chǎn)，GradeⅤ5503； 氫氧化鋁（分析純）： 天津博迪化工股份有限公司； 地塞米松磷酸鈉注射液（1 mL∶5 mg）： 山西晉新雙鶴藥業(yè)； 水合氯醛： 由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心提供， 臨用前用蒸餾水配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛溶液（10 mL： 1 g）； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛： 貨號MAIDF0151， 北京麥瑞博生物科技有限公司； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鋨酸： CAS號： 20816-12-0， 美國斯百全公司。

1.4 穴位貼敷藥

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部制備， 藥物組成： 延胡索、白芥子各2份， 細(xì)辛、生甘遂、麻黃、生川烏、牙皂、桂枝、丁香、葶藶子各1份，打粉后加生姜汁， 合凡士林做成0.5 cm×0.5 cm大小藥丸（重約0.3 g，相當(dāng)于生藥量約0.15 g），用膠布固定制成貼劑。

1.5 大鼠哮喘模型建立

參考Palmans方法［2］制備OVA致敏的哮喘大鼠模型。第1日給予B， C， D組大鼠腹腔注射OVA和氫氧化鋁混合溶液1 mL（含OVA10 mg、氫氧化鋁100 mg）， 第8日再次腹腔注射加強致敏。第15日開始， 將B， C， D組大鼠置于自備密閉霧化箱內(nèi)，給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%OVA溶液100 mL超聲霧化，隔日1次，每次30 min。直到第56日霧化結(jié)束。大鼠出現(xiàn)煩躁、呼吸頻率加快、腹式呼吸明顯、點頭運動、可聞及哮鳴音等癥狀，提示造模成功［3］。

1.6 治療

第57日起對C，D組進(jìn)行治療。A、B組： 正常喂養(yǎng)。C組： 地塞米松1 mg/kg， 每日1次腹腔注射。D組： 咳喘停貼劑外用于雙側(cè)肺俞、脾俞、腎俞穴［4］（每鼠用藥量1.8 g/次， 相當(dāng)于生藥量約1 g/次），6 h后去除，每日1次。共治療14 d。治療結(jié)束后取材觀察。

1.7 取材

治療結(jié)束后， 用10%水合氯酸（按每鼠3.5 mL/kg），腹腔注射麻醉。采集頸靜脈血1 mL，裝于EDTA抗凝管中，在全自動血液細(xì)胞分析儀上測定白細(xì)胞總數(shù)（RBC）和嗜酸粒細(xì)胞（EOS）百分比。取肺組織（1 mm×1 mm×1 mm）大小，用2.5%戊二醛固定2 h后漂染，1%鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，透射電鏡觀測肺組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20統(tǒng)計軟件， 檢測結(jié)果以x- ± s表示，應(yīng)用正態(tài)分布、方差齊的組間差異性比較采用單因素方差分析； 非正態(tài)分布或者方差不齊，采用多個獨立樣本的非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis H檢驗）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘大鼠全血RBC和EOS百分比

結(jié)果顯示，模型組大鼠全血RBC和EOS較正常組明顯增加（P＜0.05），各治療組大鼠全血RBC和EOS較模型組明顯減少（P＜0.05）（表1）。

2.2 哮喘大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)

在電子顯微鏡下： 正常大鼠肺組織肺泡壁表面的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)良好，表面微絨毛形態(tài)正常，排列整齊（圖1A）； 哮喘大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞板層小體排空現(xiàn)象較多，細(xì)胞表面微絨毛明顯減少，排列混亂（圖1B）。經(jīng)地塞米松治療后肺泡上皮細(xì)胞板層小體僅部分空泡化，細(xì)胞表面微絨毛有所減少（圖1C）。穴位貼敷組肺泡上皮細(xì)胞板層小體僅部分空泡化，肺泡上皮增生，細(xì)胞表面微絨毛有所減少（圖1D）。

表1 穴位貼敷對哮喘大鼠全血RBC和EOS的影響

3 討論

目前治療哮喘最有效、最常用的依然是糖皮質(zhì)激素。但應(yīng)用激素仍不能較好改善哮喘復(fù)發(fā)情況，卻帶來患者依從性差及藥物依賴性等許多問題。南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院通過改良《張氏醫(yī)通》中白芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛這一貼敷傳統(tǒng)劑型，降低了藥物的刺激性，而保留了治療哮喘的有效成分，加強了穴位貼敷的安全性和有效性。從本次試驗可以看到穴位貼敷及地塞米松對EOS和哮喘肺組織微結(jié)構(gòu)的影響。

EOS釋放的白三烯及堿性蛋白等化學(xué)物質(zhì)是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和加重氣道炎癥反應(yīng)的重要因素［5］。當(dāng)EOS在肺組織發(fā)生聚集并釋放一系列促炎癥反應(yīng)及細(xì)胞毒素產(chǎn)物，引起肺組織上皮損傷增加了氣道反應(yīng)性從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)作。各治療組大鼠全血中RBC和EOS百分率明顯下降，提示穴位貼敷治療哮喘可能通過減少大鼠血和氣道中RBC和EOS數(shù)量減少炎性細(xì)胞尤其是EOS在肺組織中的浸潤，減輕哮喘氣道炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮平喘作用。

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病， 在顯微鏡下可見氣道上皮下有肥大細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、EOS、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤。氣道粘膜下組織水腫， 微血管通透性增加， 支氣管內(nèi)分泌物貯留，支氣管平滑肌痙攣， 纖毛上皮剝離， 基底膜露出， 杯狀細(xì)胞增殖及支氣管分泌物增加等病理改變。

圖1 大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察

肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變可以較好反映氣道慢性炎癥等病理變化情況。據(jù)研究表明哮喘大鼠肺間質(zhì)內(nèi)有大量纖維組織增生，組織內(nèi)有大量單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞等細(xì)胞浸潤，肺泡Ⅱ型細(xì)胞板層小體和線粒體較少，而且有明顯排空和空泡化改變［6］。

電子顯微鏡觀察大鼠肺組織的肺泡上皮細(xì)胞顯示，穴位貼敷可有效改善哮喘大鼠肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，且療效與地塞米松療效無明顯差異，提示穴位貼敷能通過減輕肺泡上皮細(xì)胞壞死達(dá)到治療哮喘的目的。

本實驗提示， 穴位貼敷可抑制哮喘大鼠炎癥細(xì)胞浸潤， 通過減輕肺泡上皮細(xì)胞壞死從而發(fā)揮類似于糖皮質(zhì)激素治療哮喘作用。穴位貼敷療法具有簡便易廉的特點， 值得在治療哮喘這一疾病中推廣應(yīng)用。

本次實驗缺少對貼敷次數(shù)及貼敷時間的對比研究，在以后研究中應(yīng)進(jìn)一步加強貼敷時效研究為更科學(xué)的安排治療時間提供依據(jù)。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南（2008年修訂版）［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志， 2008， 31（3）：177-185.

［2］ Palmans E， Kips JC， Pauwels RA， et al.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats ［J］.Am J Respir Crit Care Med， 2000， 161（21）：627-635.

［3］ 喬明， 劉蘭英， 王和生.慢性過敏性哮喘大鼠模型的建立與評價［J］.實驗動物與比較醫(yī)學(xué)， 2014， 34（1）：79-82.

［4］ 李忠仁.實驗針灸學(xué)［M］.北京： 中國中醫(yī)藥出版社， 2003：325-326.

［5］ Lee CC， Huang HY， Chiang BL.Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness［J］.Hum Gene Ther， 2011， 22（5）：577-586.

［6］ 郁志偉， 張建華.布地奈德對哮喘小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的影響 ［J］.臨床兒科雜志， 2009， 27（9）：870-872.

Effect of Acupoint Sticking Therapy on Eosinophils and Ultrastructure of Lung Tissue in Asthmatic Rats

QIAO Ming1， YANG Zheng-ming1， HUANG Qian1， LIU Lan-ying2
（1.Lianyungang Hospital of TCM， Lianyungang 222000， China；
2.Jiangsu Province of TCM， Nanjing 210000， China）

Objective To observe the effect of acupoint sticking therapy on eosinophils infiltration and the lung tissue ultrastructure of asthmatic rats.Methods Using rat model of asthma which is established following Palmans’ method， we observed the effect of acupoint sticking therapy on the whole blood leukocyte count， eosinophils and ultrastructural changes in lung tissue.Results The whole blood leukocytes and eosinophils counts were significantly increased in asthma model group compared with the sham group.After treatment with acupoint sticking therapy， the whole blood leukocytes and eosinophils counts were significantly decreased and the ultrastructure of alveolar epithelial cells was also obviously improved in asthma rats.Conclusion Acupoint sticking therapy can reduce the whole blood leukocytes and eosinophils counts and alleviate inflammatory cell infiltration and alveolar epithelial cell necrosis in the lung of asthmatic rats to treat asthma.

Acupoint sticking therapy； Asthma； Eosinophils； Lung Tissue； Ultrastructure； Electron microscope

R33-33 Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0276-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.006

2016-03-24

國家自然科學(xué)基金（81102632）

喬 明（1991-）， 男， 碩士， 針灸推拿。E-mail： 470522236@qq.com