猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒p27基因的克隆表達(dá)及診斷價值評價

周 潔， 楊燕飛，2， 胡建華， 陶凌云， 高 誠（2.上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心， 上海20203； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 揚(yáng)州225009）

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒p27基因的克隆表達(dá)及診斷價值評價

周 潔1， 楊燕飛1，2， 胡建華1， 陶凌云1， 高 誠1
（2.上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心， 上海201203； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院， 揚(yáng)州225009）

目的 克隆表達(dá)猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒（SRV） p27基因，評價其診斷價值。方法 PCR擴(kuò)增p27基因片段，定向克隆至原核表達(dá)載體pET-28b（+），重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta （DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，目的蛋白經(jīng)鎳柱親和層析純化后用ELISA方法評價其診斷價值。結(jié)果 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后在37 ℃，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）濃度為0.5 mmol/L的條件下誘導(dǎo)4 h，可溶性p27蛋白表達(dá)量最大，且具有免疫學(xué)活性。純化后測定融合蛋白濃度為2.043 g/L，純度93.3%，以融合蛋白為診斷抗原包被ELISA板檢測3份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和22份陰性血清，檢出率為100% 。結(jié)論 p27 基因成功表達(dá)并具有良好的反應(yīng)原性，可作為猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒血清學(xué)檢測的候選抗原。

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒； p27基因； 原核表達(dá)； 血清學(xué)檢測

猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒（simian type-D retrovirus，SRV）， 屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科腫瘤病毒亞科的D型病毒， 是猴獲得性免疫缺陷綜合征（simian acquired immunodeficiency syndrome， SAIDS）即猴艾滋病的主要病原體之一［1］。SRV的自然宿主是獼猴， 主要通過猴間互相撕咬使唾液中的病毒進(jìn)入血液而傳播， 也可通過性傳播和胎盤傳播。感染后的臨床表現(xiàn)和病理特征與人艾滋病類似， 如頑固性腹瀉、貧血、體質(zhì)量減輕、脾腫大、淋巴結(jié)病、慢性感染并對治療不產(chǎn)生療效反應(yīng)、壞死性口炎、表皮和腹膜后纖維瘤等。SRV在其天然宿主亞洲猴群中流行率較高， 有的猴群可達(dá)100%，1970年代末和1980年代初， 美國幾個靈長類研究中心爆發(fā)SRV導(dǎo)致了大批實(shí)驗(yàn)用猴死亡， 近年來還有SRV感染人的報道［2-6］。

由于猴在形態(tài)學(xué)、生殖生理特性和生化代謝等方面與人類非常類似，其遺傳物質(zhì)和人類有很高的同源性，因此猴被作為人類最理想的替身和重要的研究、實(shí)驗(yàn)對象，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的科學(xué)研究，特別是在新藥臨床前安全性評價中猴是不可替代的實(shí)驗(yàn)動物。其質(zhì)量不僅直接影響科學(xué)研究的進(jìn)程和結(jié)果，而且也直接影響從事實(shí)驗(yàn)動物科研、生產(chǎn)等相關(guān)人員的生命健康和安全以及社會公共衛(wèi)生體系的安全［7］。因此需要定期對猴群進(jìn)行SRV感染的監(jiān)測以剔除傳染源，必要時使用疫苗。我國國標(biāo)GB/T 14926.61-2001［8］規(guī)定SRV是SPF級猴的必檢項(xiàng)目，推薦方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）或免疫熒光試驗(yàn)（IFA）。目前除了美國BioReliance和VRL等少數(shù)幾個實(shí)驗(yàn)室擁有實(shí)驗(yàn)猴SRV的ELlSA試劑盒之外，市場上還沒有同類產(chǎn)品出售。國外試劑盒價格昂貴且貨期不穩(wěn)定，因此建立一種快速、準(zhǔn)確的SRV檢測方法有助于國內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)猴SRV的檢測工作。本研究對SRV的高度保守序列p27基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，并對其診斷價值進(jìn)行了評價，為進(jìn)一步開展SRV的快讀診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌株及載體 SRV-2株細(xì)胞培養(yǎng)物、pET-28b（+）載體質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存； pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司生物公司； 感受肽細(xì)胞E.coli Rosetta （DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit購自Qiagen公司（德國）； PrimeSTAR Max DNA Polymerase聚合酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPS、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司生物公司； 辣根過氧化物酶（HRP）酶標(biāo)山羊抗猴IgG購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司； 瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司； Ni-IDA-SefinoseTMResin試劑盒購自生工生物工程上海（股份）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GenBank發(fā)表的SRV-2株基因序列（16605.1）， 針對p27基因（nt1385～nt2062）設(shè)計一對特異性引物， 用于擴(kuò)增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)；

下游引物：5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)；

SRV細(xì)胞培養(yǎng)物病毒總RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書操作； 反轉(zhuǎn)錄過程參照AMV逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書； 取上述3 μL cDNA產(chǎn)物作為PCR模板，PCR反應(yīng)條件為： 通過RT-PCR方法擴(kuò)增p27 基因， 擴(kuò)增條件為： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s， 72 ℃ 45 s， 30個循環(huán)； 72 ℃5 min?；厥誔CR產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)胞，提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pMD-P27。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pMD-P27經(jīng)Xho I/ Nde I雙酶切后與進(jìn)行同樣處理的pET-28b（+）載體相連，接連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli Rosetta（DE3）細(xì)胞，鑒定后獲得的陽性質(zhì)粒命名為pET-P27。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pET- P27轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3），挑取單菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至A600值0.6左右時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG， 220 r/min，37 ℃誘導(dǎo)4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的陽性菌液作為陰性對照。離心收集菌體細(xì)胞， 用緩沖液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TritonX-100，pH8.0）重懸，冰浴中超聲破碎菌體，分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500 μL包涵體溶解液（8 m/L 尿素， 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體超聲處理后，上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin試劑盒純化， 具體步驟如下： 取5 mLNi-IDA， 用10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液（binding buffer）清洗平衡柱子，流速5 mL/min； 上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗緩沖液（wash buffer）洗去雜質(zhì)，流速2 mL/min，收集洗脫液； 洗脫緩沖液（elution buffer）洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。將收集到的各組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測后，將純度最好的組分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，測定蛋白的濃度（具體操作按照生工的SK3071非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進(jìn)行）及純度，-80℃分裝保存。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上， 加封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）溫室搖床封閉1 h； 先后以50倍稀釋的SRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清4 ℃孵育過夜，2 000倍稀釋的羊抗猴IgG-HRP溫室搖床孵育1 h，TMB顯色。

1.2.6 重組蛋白的診斷價值評價 以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板（濃度為3.063 mg/孔）4℃包被過夜； 封閉緩沖液（blocking buffer）于37 ℃封閉2.5 h； 標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清1∶100稀釋， 作用60 min； 酶標(biāo)二抗1：10 000稀釋，底物顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)； 酶標(biāo)儀測量A630值， 以陰性血清的平均A630值乘以2.1作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得大小約為750 bp 的特異性片斷（圖1），與預(yù)期大小相符，連接pMD18-T 載體測序，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增片斷723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，編碼226 aa。將pMD-P27雙酶切后與同樣處理的pET-28b（+）載體連接，獲得陽性質(zhì)粒pET- P27。設(shè)計一對特異性引物，用于擴(kuò)增p27基因。

上游引物： 5'-AGCCATATGATTTTCCCAGTAACG-3'，引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)；

下游引物： 5'-TGATCTCGAGGTCTGTCCACTAAAG-3'， 引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)；

SRV細(xì)胞培養(yǎng)物病毒總RNA的提取按照QIAamp Viral RNA Mini 試劑盒說明書操作； 反轉(zhuǎn)錄過程參照AMV逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書； 取上述3 μL cDNA產(chǎn)物作為PCR模板，PCR反應(yīng)條件為： 通過RT-PCR方法擴(kuò)增p27 基因， 擴(kuò)增條件為： 95 ℃ 3 min；95 ℃ 22 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min?；厥誔CR產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α細(xì)胞，提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pMD-P27。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pMD-P27經(jīng)Xho I/ Nde I雙酶切后與進(jìn)行同樣處理的pET-28b（+）載體相連，接連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3）細(xì)胞，鑒定后獲得的陽性質(zhì)粒命名為pET-P27。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pET- P27轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli Rosetta （DE3），挑取單菌落于含30 mg/L卡那霉素和34 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)至A600值0.6左右時添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min， 37 ℃誘導(dǎo)4 h，未加IPTG誘導(dǎo)劑的陽性菌液作為陰性對照。離心收集菌體細(xì)胞， 用緩沖液（20 mmol/L PB， 300 mmol/L NaCl，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TritonX-100，pH8.0）重懸，冰浴中超聲破碎菌體， 分別離心收集上清和沉淀， 沉淀用500 μL包涵體溶解液（8 m/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0）溶解，分別用于SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量誘導(dǎo)表達(dá)后離心收集菌體超聲處理后， 上清用Ni-IDA-SefinoseTMResin 試劑盒純化， 具體步驟如下： 取5 mL Ni-IDA， 用10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗平衡柱子， 流速5 mL/min；上柱，流速為2 mL/min，收集穿透液； 10倍柱床體積的結(jié)合緩沖液清洗柱子，流速5 mL/min； 漂洗緩沖液洗去雜質(zhì)，流速2 mL/min， 收集洗脫液； 洗脫緩沖液洗脫，流速2 mL/min，收集洗脫液。將收集到的各組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測后，將純度最好的組分透析至1×PBS，pH8.0中，0.45 μm濾膜過濾濃縮分裝，測定蛋白的濃度（具體操作按照生工的SK3071非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進(jìn)行）及純度，-80℃分裝保存。

1.2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）溫室搖床封閉1 h； 先后以50倍稀釋的SRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清4 ℃孵育過夜， 2 000倍稀釋的羊抗猴IgG-HRP溫室搖床孵育1 h， TMB顯色。

1.2.6 重組蛋白的診斷價值評價 以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板（濃度為3.063 mg/孔）4℃包被過夜； 封閉緩沖液（blocking buffer）于37 ℃封閉2.5 h； 標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清1∶100稀釋， 作用60 min； 酶標(biāo)二抗1∶10 000稀釋，底物顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)； 酶標(biāo)儀測量A630值，以陰性血清的平均A630值乘以2.1作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得大小約為750 bp 的特異性片斷（圖1），與預(yù)期大小相符，連接pMD18-T載體測序， 結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增片斷723 bp， 包含有SRV-2 p27完整ORF共678 bp，編碼226 aa。將pMD-P27雙酶切后與同樣處理的pET-28b（+）載體連接，獲得陽性質(zhì)粒pET- P27。

2.2 重組蛋白的表達(dá)及活性鑒定

圖1 RT-PCR擴(kuò)增p27基因產(chǎn)物M： DNA molecular weight standards； 1： Water control；2： RT-PCR products Figure 1 RT-PCR products of p27 gene

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta （DE3）， 37℃， IPTG濃度0.5 mmol/L誘導(dǎo)4 h表達(dá)量最大， 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組蛋白以上清形式表達(dá)，蛋白分子量約29000， 與預(yù)期相符（圖2）， Western blot 結(jié)果表明重組蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)原性（圖3）。

2.3 重組蛋白純化

表達(dá)菌大量誘導(dǎo)表達(dá)后收集裂解上清， 經(jīng)Ni-IDA過柱純化后蛋白大小與純化前一致（圖4），按照SK3071 非干擾型蛋白濃度測定試劑盒說明書，以不同體積蛋白的480 nm吸收值的平均值作為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的BSA蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，按照480 nm吸光度與蛋白質(zhì)量的線性關(guān)系為y=-0.0043x+1.1157，求得目的蛋白濃度為2.043 mg/mL，薄層掃描確定其純度為93.3%。蛋白測定結(jié)果見表1，圖5。

圖2 SDS-PAGE檢測重組p27蛋白在Rosetta中的表達(dá)Figure 2 Expression of recombinant p27 protein in E.coli Rosetta analyzed by SDS-PAGE

圖3 重組p27蛋白Western-blot 分析結(jié)果Figure 3 Western blot analysis of recombinant p27 protein

表1 各體積蛋白的480 nm吸收值及對應(yīng)BSA蛋白濃度測定Table1 480nm absorption value of each volume protein and its corresponding BSA protein concentration

2.4 重組p27蛋白的診斷價值評價

以純化的重組蛋白作為診斷抗原包被ELISA板，對3份標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和22份陰性血清進(jìn)行檢測，3份陽性血清的A630值在0.355～1.210，22份陰性血清A630值在0.072～0.228，平均值為0.133，按照陰性平均A值的2.1 倍計算，陽性判定閾值為0.278。3份陽性血清檢出率及22份陰性血清檢出率為100%。

圖5 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 5 BSA standard curve

D型逆轉(zhuǎn)錄病毒分為內(nèi)源性病毒（SERV）和外源性病毒（SRV）。SRV是引起SAIDS的主要病原。目前發(fā)現(xiàn)的SRV有7個血清型，其中，SRV-1～3已測序完成［9］。SRV的基因組結(jié)構(gòu)與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相似， 兩端為長末端重復(fù)序列（LTR）， 其在病毒DNA的合成、整合和病毒基因的表達(dá)等方面起調(diào)節(jié)作用。中間包含4個開放閱讀框架（ORF）， 從5'端至3'端依次為： （1）編碼核心蛋白的gag基因， 它編碼一個大的前體核心蛋白，在病毒成熟過程中， 被蛋白酶水解成6個核心蛋白： p10、pp24、pp18、p12、p27、p14、p4； （2）編碼蛋白酶（Protease）的prt基因；（3）編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和整合酶（核酸內(nèi)切酶）的pol基因； （4）編碼囊膜蛋白（包括外膜蛋白gp70、跨膜蛋白gp20）的env基因。在env基因之后還有一個意義不明的延伸到右側(cè)LTR的短ORF［10，11］。

表2 重組蛋白對標(biāo)準(zhǔn)血清的ELISA檢測結(jié)果Table2 Result of ELISA with recombinant protein to test standard sera

SRV不同血清型之間有交叉反應(yīng)， 主要發(fā)生在衣殼蛋白p27和跨膜蛋白gp20～gp22區(qū)域， 在D型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中它們是高度保守的一段序列［12］。本研究選取編碼p27蛋白的基因作為研究對象，將其完整ORF插入原核表達(dá)載體pET-28b（+）的多克隆位點(diǎn)區(qū)，在37 ℃，IPTG濃度0.5 mmol/L 的條件下誘導(dǎo)4 h， 蛋白獲得較高水平的表達(dá)， 且以上清形式存在。目的蛋白大小約29 000 （含His標(biāo)簽），與預(yù)期大小一致，Western blot 證實(shí)重組蛋白與猴SRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性?；谌诤系鞍姿鶐У?個組氨酸標(biāo)簽，利用Ni-IDA柱對重組蛋白進(jìn)行了純化， 并獲得了較高純度的蛋白。將純化的重組蛋白作為包被抗原， 通過間接ELISA方法嚴(yán)證重組蛋白的診斷價值。結(jié)果顯示，3份陽性血清的A630值在0.355～1.210， 22份陰性血清A630值在0.072～0.228， 平均值為0.133， 按照陰性平均A值的2.1 倍計算，陽性判定閾值為0.278。3份陽性血清檢出率及22份陰性血清檢出率為與VRL的SRV試劑盒完全相符。本結(jié)果顯示，重組蛋白具有血清學(xué)診斷價值，為下一步建立診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

［1］ Gardner MB， Marx PA.Simian acquired immunodeficiency syndrome［J］.Adv Virol Oncol， 1985（5）：57-81.

［2］ Hampton AL， Colby LA， Bergin IL Facial paralysis and lymphocytic facial neuritis in a rhesus macaque（Macaca mulatta）positive for simian retrovirus type D2.［J］.Comp Med， 2011， 61（6）：538-545.

［3］ 王蕓， 呂龍寶， 馬玉華， 等.猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒的研究進(jìn)展［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊， 2012， 6：14-15.

［4］ 陳志斌， 賁昆龍.猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒和猴艾滋?。跩］.動物學(xué)研究， 1992， 13（2）：193-199.

［5］ Lerche NW， Marx PA， Osborn KG， et a1.Natura1 history of endemic type D retrovirus infection and acquired immune deficiency syndrome in group-housed rhesus monkeys［J］.Natl Cancer Inst， 1987， 79（4）：847-854.

［6］ Montiel NA.An updated review of simian beta retrovirus （SRV） in macaque hosts ［J］.J Med Primatol， 2010， 39（5）：303-314.

［7］ 張高紅， 李明華， 鄭永唐.AIDS獼猴模型在HIV疫苗研究中的應(yīng)用［J］.動物學(xué)研究， 2007， 28（5）：556-562.

［8］ GB/T 14926.61-2001.猴逆轉(zhuǎn)D型病毒檢測方法［S］.

［9］ Nandi JS， Tikute SA， Chhangani AK， et a1.Natural infection by simian retrovirus-6（SRV-6） in Hanuman langurs （Semnopithecus entellus） from two different geographical regions of India［J］.Virology， 2003， 3l1（1）：192-201.

［10］ Hara M， Sata T， Kikuchi T， et al.Isolation and characterizationof a new simian retrovirus type D subtype from monkeys at the Tsukuba Primate Center， Japan［J］.Microbes Infect， 2005，7（1）：126-131.

［11］ Van der Kuyl AC， Mang R， Dekker JT， et al.Complete nucleotide sequence of simian endogenous type D retrovirus with intact genome organization： evidence for ancestry to simian retrovirus and baboon endogenous virus［J］.J Virol，1997， 71（5）：3666-3676.

［12］ Sonigo P， Barker C， Hunter E， et al.Nucleotide sequence of Mason-Pfizer monkey virus： an immune-suppressive D-type retrovirus［J］.Cell， 1986， 45（3）：375-385.

Production of Recombinant Simian Type-D Retrovirus p27 Gene and Evaluation of its Diagnostic Potential

ZHOU Jie1， YANG Yan-fei1，2， HU Jian-hua1， TAO Ling-yun1， GAO Cheng1
（1.Shanghai Research Center of Laboratory Animal， Shanghai 201203；
2.Yangzhou University College of Veterinary， Yangzhou 225009）

Objective To Clone and express p27 gene of simian type-D retrovirus and evaluate its diagnostic potential.Method The p27 gene was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expressive vector pET-28b（+） after sequencing.Recombinant plasmid was transformed into E.coli Rosetta DE3） and recombinant protein was analysed by SDS-PAGE and Western blot.The protein was purified affinity chromatography with Ni-NTA， and its diagnostic value was evaluated by ELISA.Results The highest soluble expression level of recombinant protein was obtained after being induced at 37℃ for 4 h，with the concentration of Isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） was 0.5 mmol/L， and the recombinant protein had immunological activity.After purified， the concentration of protein was 2.043 g/L， and the purity was 93.3%.The indirect ELISA was developed using the purified recombinant protein，detection of 3 standard positive sera and 22 negative sera showed the detection rate were 100%.Conclusion Recombinant p27 protein from prokaryotic expression system had perfect antigenicity，which would can be used as the candidate antigen of simian type-D retrovirus.

Simian type-D retrovirus； p27 gene； Prokaryotic expression； Serological detection

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0270-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.005

上海市科委科技創(chuàng)新行動計劃（13140900600）， 上海市科委研發(fā)平臺專項(xiàng)（15DZ2292400）

周 潔（1978-）， 女， 博士， 副研究員， 主要從事動物病毒分子生物學(xué)及免疫學(xué)方面的研究。E-mail： zhoujie0526@163.com

高 誠（1961-）， 男， 研究員。E-mail： gaochengdgb@126.com