人肺癌原位移植瘤模型的建立及活體成像觀察

劉 乾， 劉 松， 韓鋒鋒， 郭雪君（上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科， 上海 200092）

人肺癌原位移植瘤模型的建立及活體成像觀察

劉 乾， 劉 松， 韓鋒鋒， 郭雪君
（上海市交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院呼吸科， 上海 200092）

目的 通過(guò)建立人肺癌原位移植瘤模型，研究人肺癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞的體內(nèi)生物學(xué)特性。方法 應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白及熒光素酶（GFP/Luc）的人肺癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞SPC-A-1和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞SPC-A-1sci，在此基礎(chǔ)上，建立裸小鼠肺原位移植瘤動(dòng)物模型，采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)和解剖學(xué)方法觀察腫瘤在肺原位的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果 成功建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP/Luc的人肺癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞，并成功建立了肺癌原位移植瘤動(dòng)物模型。小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)顯示，SPC-A-1-GFP-Luc和SPC-A-1sci-GFP-Luc細(xì)胞模型中熒光素酶表達(dá)率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32），SPC-A-1sci-GFP-Luc組熒光素酶表達(dá)的面積及表達(dá)強(qiáng)度高于SPC-A-1-GFP-Luc組。解剖學(xué)檢查顯示， SPC-A-1和SPC-A-1sci組的肺原位成瘤率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32）； 體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移率分別為25%（3/12）和40%（8/20）。結(jié)論 通過(guò)建立肺原位移植瘤動(dòng)物模型能夠再現(xiàn)腫瘤在肺內(nèi)的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠?qū)ζ渖飳W(xué)特性進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。

人肺癌； 原位移植； 活體成像系統(tǒng)； 慢病毒載體

肺癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織和美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)估計(jì)全世界每年新發(fā)生癌癥患者約1 000萬(wàn)人，死亡癌癥患者約600～700萬(wàn)人， 其中100～130萬(wàn)人為肺癌患者， 由肺癌引起的死亡率在很多國(guó)家已位居常見(jiàn)死亡原因首位［1，2］。盡管目前對(duì)肺癌的早期診斷和臨床治療較從前有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但不容忽視的是肺癌患者大多在中晚期才被確診，且90%以上肺癌患者死于轉(zhuǎn)移［3］。

腫瘤動(dòng)物模型在腫瘤研究中具有非常重要作用，通過(guò)建立腫瘤動(dòng)物模型能夠更好地在整體水平上研究腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)旨在利用人肺癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞建立裸小鼠肺原位移植瘤動(dòng)物模型，通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)觀察肺原位移植瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，為肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制、肺癌診斷、治療及抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)等提供有用的工具。

1 材料與方法

1.1 人肺癌細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株SPC-A-1及其高轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞系SPC-A-1sci為人低分化腺癌，SPC-A-1-GFP/Luc及SPC-A-1sci-GFP/Luc細(xì)胞為表達(dá)綠色熒光蛋白和熒光素酶（GFP/Luc）的雙標(biāo)記細(xì)胞， 以上細(xì)胞均由上海市腫瘤研究所提供。細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco modified Eagle medium）高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)， 內(nèi)含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞融合率為80%～90%時(shí)， 用含體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化并傳代，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c裸小鼠56只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由上海市腫瘤研究所提供［SCXK（滬）2012-0001］，所用墊料、飲水、全價(jià)顆粒飼料及其它與動(dòng)物接觸的物品均經(jīng)高壓滅菌處理。實(shí)驗(yàn)操作及動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照SPF級(jí)規(guī)范要求進(jìn)行［SYXK（滬）2012-0001］。

1.3 試劑儀器

胎牛血清購(gòu)自Biowest公司（法國(guó)）； DEME高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）； Matrigel購(gòu)自BD公司（美國(guó)）； 熒光底物購(gòu)自GOLD Bio Technology公司（美國(guó)）； 培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購(gòu)自Corning公司（美國(guó)）； 戊巴比妥鈉購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司； 青霉素和鏈霉素等其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝試劑。

小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)購(gòu)自Berthold Technologies GmbH&Co.KG（德國(guó)），儀器型號(hào)為L(zhǎng)B983 NC320，分析軟件為WinLight32，320萬(wàn)像素的冷CCD，濾光片的光譜范圍為300～1 100 nm。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司（美國(guó)）， 儀器型號(hào)： cell 150。熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司（日本）。

1.4 肺癌原位移植瘤模型的建立及活體成像觀察

收集生長(zhǎng)旺盛的連續(xù)傳代SPC-A-1 GFP/Luc及SPC-A-1sci GFP/Luc細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×107個(gè)/mL，取25 μL細(xì)胞懸液與25 μL Matrigel 1∶1混勻，置于冰上備用。裸小鼠以戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，酒精棉球消毒皮膚，在左胸壁行1 cm的切口，分離胸壁肌肉，暴露肋肌及肋間肌， 在第3、第4肋間斜行進(jìn)針，刺入左肺約3 mm左右，緩慢推入備用細(xì)胞，皮膚切口以4/0縫線緊密縫合， 定時(shí)觀察動(dòng)物的進(jìn)食、活動(dòng)等一般狀況。

為了進(jìn)一步觀察人肺癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞SPCA-1sci和SPC-A-1的體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移能力，待動(dòng)物出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)時(shí)進(jìn)行小動(dòng)物活體成像觀察。預(yù)先將配置的20 mg/mL D-Luciferin工作液從-70 ℃中移至4 ℃冰箱中解凍。每只動(dòng)物取0.15 mL進(jìn)行腹腔注射， 然后進(jìn)行戊巴比妥鈉腹腔注射。待小鼠麻醉后，將其放入成像系統(tǒng)暗室中，先拍攝明場(chǎng)圖像，隨后切換至生物發(fā)光成像模式，收集5 min熒光素酶表達(dá)光子信號(hào)，然后再將光子圖像與明場(chǎng)圖像疊加，觀察生物發(fā)光信號(hào)位置及表達(dá)強(qiáng)度。

影像學(xué)檢測(cè)完成后，行頸椎脫臼法處死動(dòng)物進(jìn)行解剖，肉眼觀察肺部成瘤及轉(zhuǎn)移情況，取全部肺組織及轉(zhuǎn)移灶組織放入含體積分?jǐn)?shù)10%甲醛的離心管中進(jìn)行固定。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP/Luc的肺癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

SPC-A-1sci細(xì)胞為經(jīng)過(guò)動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)篩選獲得的具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞系，在體外培養(yǎng)過(guò)程中，可見(jiàn)兩種不同轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞間的細(xì)胞形態(tài)學(xué)具有明顯差異。GFP/Luc雙標(biāo)SPC-A-1細(xì)胞為典型的多角形上皮樣細(xì)胞，簇狀貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密相靠、互相銜接，呈鵝卵石樣外觀，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞表達(dá)的熒光信號(hào)較強(qiáng)，熒光較為均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)，GFP表達(dá)率接近100%。GFP/Luc雙標(biāo)的SPC-A-1sci細(xì)胞呈紡錘體樣外形，細(xì)胞間相互離散， 失去上皮細(xì)胞的極性特性，并且有明顯偽足形成，GFP轉(zhuǎn)染率為70%左右，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分選后，GFP表達(dá)率接近100%（圖1）。

2.2 應(yīng)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)肺原位腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況

裸小鼠肺原位分別接種上述兩種細(xì)胞各1×106/只， 1～2周時(shí)動(dòng)物進(jìn)食、進(jìn)水、呼吸、運(yùn)動(dòng)情況良好； 4周時(shí)，兩組小鼠開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)減弱、弓背等狀態(tài)，5周后部分動(dòng)物開(kāi)始出現(xiàn)消瘦、弓背明顯、胸腹聯(lián)合呼吸、萎靡、食欲減退等惡病質(zhì)狀態(tài)。第6周開(kāi)始，對(duì)于出現(xiàn)惡病質(zhì)狀態(tài)的動(dòng)物，每周分批運(yùn)用小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)腫瘤原位生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況，至第9周實(shí)驗(yàn)全部結(jié)束。結(jié)果顯示： 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)觀察到SPC-A-1-GFP/Luc細(xì)胞模型中有12只裸小鼠肺部呈現(xiàn)熒光素酶表達(dá)，表達(dá)率為50%（12/24）（圖2）；SPC-A-1sci-GFP/Luc細(xì)胞模型中有20只裸小鼠肺部呈現(xiàn)熒光素酶表達(dá)，表達(dá)率為62.5%（20/32），其余動(dòng)物未檢測(cè)到任何熒光素酶信號(hào)（圖3）。兩組中，盡管各組動(dòng)物間熒光素酶表達(dá)的面積和強(qiáng)度略有不同，但SPC-A-1sci-GFP/Luc組熒光素酶表達(dá)的面積及表達(dá)強(qiáng)度總體高于SPC-A-1-GFP/Luc組。

2.3 解剖學(xué)觀察肺原位移植瘤腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況

對(duì)于處于惡病質(zhì)狀態(tài)的動(dòng)物， 在經(jīng)過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)后， 繼續(xù)行頸椎脫臼法處死小鼠并進(jìn)行解剖學(xué)檢查， 觀察雙肺成瘤情況及體內(nèi)臟器轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示： 人肺癌細(xì)胞SPC-A-1和SPC-A-1sci在左肺表面皆可呈現(xiàn)魚(yú)肉狀的透明結(jié)節(jié)， 凸出于肺表面或侵入肺深部生長(zhǎng)， 有的可累及整個(gè)左肺， 腫瘤大小不一， 成瘤率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32）；在成瘤動(dòng)物中，它們各自的體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移率分別為25%（3/12）和40%（8/20），轉(zhuǎn)移主要位于胸腔的右肺、胸壁、膈等部位，可見(jiàn)大小不一的魚(yú)肉狀透明結(jié)節(jié)凸出生長(zhǎng)于轉(zhuǎn)移位置，而肝、腎、腎上腺、骨骼等未見(jiàn)腫瘤浸潤(rùn)（表1、圖4、圖5）。

圖1 穩(wěn)定表達(dá)GFP/Luc的SPC-A-1和SPC-A-1sci細(xì)胞 （100×）Figure 1 Morphological analysis of stable GFP/Luc expressing SPC-A-1 and SPC-A-1sci cells in vitro （100×）

圖2 小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)SPC-A-1-GFP/Luc細(xì)胞肺原位移植瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力Figure 2 Monitoring of the proliferation and spontaneous metastasis of SPC-A-1-GFP/Luc cells in lung orthotopic animal models by in vivo biofluorescent imaging

圖3 小動(dòng)物活體成像技術(shù)檢測(cè)SPC-A-1sci-GFP/Luc細(xì)胞肺原位移植瘤模型的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力Figure 3 Monitoring of the proliferation and spontaneous metastasis of SPC-A-1sci-GFP/Luc cells in lung orthotopic animal models by in vivo biofluorescent imaging

表1 解剖學(xué)觀察肺原位移植瘤的腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況Table1 Observation of in vivo tumor growth and metastasis of SPC-A-1 and SPC-A-1sci cells via lung orthotopic transplantation

圖4 解剖學(xué)檢測(cè)SPC-A-1細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)情況Figure 4 Observation of in vivo tumor growth of SPC-A-1 cells via lung orthotopic transplantation

圖5 解剖學(xué)檢測(cè)SPC-A-1sci細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)情況Figure 5 Observation of in vivo tumor growth of SPC-A-1sci cells via lung orthotopic transplantation

3 討論

原位移植瘤動(dòng)物模型為研究腫瘤提供了一個(gè)良好的平臺(tái)，理想的原位移植瘤模型尤其是伴有轉(zhuǎn)移發(fā)生的模型不僅可以再現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，而且可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理及抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療研究。腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型主要分為自發(fā)性轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。目前已有的肺癌轉(zhuǎn)移模型大部分都屬于實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，即通過(guò)尾靜脈、脾臟或左心室注射等方法使腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，但實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移由于缺少了腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、突破基底膜等步驟，只能模擬轉(zhuǎn)移發(fā)生的部分過(guò)程［4，5］。自發(fā)性肺癌轉(zhuǎn)移模型能反映肺腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶、侵入細(xì)胞外基質(zhì)及血管等全部轉(zhuǎn)移過(guò)程，通常分為皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型［6，7］。薛強(qiáng)等［8］采用懸液注射法、包塊埋植并閉式引流法以及單純腫瘤埋植法等三種方法建立了兔VX2肺原位移植瘤動(dòng)物模型，但后兩種方法需要打開(kāi)胸腔，由于肺臟位于胸腔內(nèi)負(fù)壓環(huán)境中，可能存在開(kāi)胸后肺部塌陷造成動(dòng)物因呼吸衰竭而死亡，或者出現(xiàn)開(kāi)放性創(chuàng)面感染甚至發(fā)展為膿胸等并發(fā)癥。因此肺原位移植瘤模型的建立有別于其他臟器的原位移植，它具有操作難度較大，操作要求較高，應(yīng)用受到一定限制等問(wèn)題。本試驗(yàn)者通過(guò)反復(fù)練習(xí)并熟練掌握肺原位移植技術(shù)后，采用培養(yǎng)細(xì)胞注射法建立了人肺原位移植瘤動(dòng)物模型，結(jié)果顯示SPC-A-1和SPC-A-1sci組的肺原位成瘤率分別為50.0%（12/24）和62.5%（20/32）； 體內(nèi)自發(fā)轉(zhuǎn)移率分別為25.0%（3/12）和40.0%（8/20）。雖然本次試驗(yàn)原位移植成功率仍然不高，發(fā)生轉(zhuǎn)移的動(dòng)物數(shù)量十分有限，尚未達(dá)到建立模型的標(biāo)準(zhǔn)，但該實(shí)驗(yàn)為今后建立肺癌原位動(dòng)物模型提供了可行性參考依據(jù)，同時(shí)也獲得了技術(shù)支持和寶貴經(jīng)驗(yàn)。

動(dòng)物模型建立后，為了動(dòng)態(tài)觀察腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程，傳統(tǒng)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這樣一方面需要耗費(fèi)大量動(dòng)物，另一方面不能在同一動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行連續(xù)觀察，根據(jù)測(cè)量不同動(dòng)物在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)所得到的數(shù)據(jù)，會(huì)出現(xiàn)由于動(dòng)物個(gè)體差異引起的實(shí)驗(yàn)偏差。隨著小動(dòng)物影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始使用影像學(xué)方法檢測(cè)腫瘤的變化情況。魏淑珍等［9］采用開(kāi)胸的方法建立了EGFP標(biāo)記的人大細(xì)胞肺癌NCI-H460裸小鼠原位移植瘤動(dòng)物模型，結(jié)果顯示： 移植1周后通過(guò)熒光體視顯微鏡可觀察到肺部綠色熒光蛋白的表達(dá)。但是，EGFP的發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm，易被周圍組織散射，熒光不能穿透皮膚和胸壁，影像學(xué)成像時(shí)必須打開(kāi)皮瓣才能觀察到較淺部位的熒光表達(dá)， 觀察處于深部的腫瘤仍存在一定問(wèn)題。王曉敏等［10］對(duì)人肺癌及肝癌細(xì)胞進(jìn)行了GFP和熒光素酶聯(lián)合標(biāo)記，充分利用熒光素酶作為化學(xué)發(fā)光所具有的背景噪音低、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，成功觀察到了細(xì)胞在肺及肝等體內(nèi)深部的生長(zhǎng)情況。本試驗(yàn)采用相同的方法，應(yīng)用GFP/Luc雙標(biāo)技術(shù)結(jié)合小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)肺原位腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)中，小動(dòng)物活體成像檢測(cè)的肺原位腫瘤的成瘤數(shù)量和生長(zhǎng)部位都與解剖學(xué)觀察的結(jié)果相一致，說(shuō)明小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠客觀評(píng)價(jià)腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況。根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)的大小、部位以及轉(zhuǎn)移發(fā)生的程度和部位，進(jìn)行精確定量和大體定位，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)建模方法中的不足，又具有一定的檢測(cè)精確度和靈敏度，為今后的建模工作開(kāi)創(chuàng)了新思路，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究工作奠定了牢固基礎(chǔ)。但小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)只能對(duì)腫瘤進(jìn)行大體定位，不能精確區(qū)分同一部位不同深度的腫瘤，而且位置較深的腫瘤可能受解剖部位的影響而使熒光素酶表達(dá)的信號(hào)強(qiáng)度減弱，從而不能準(zhǔn)確顯示腫瘤的大小，甚至某些腫瘤未能被檢測(cè)到。

總體而言，本次實(shí)驗(yàn)成功建立了肺原位移植瘤動(dòng)物模型，觀察了人肺癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞的體內(nèi)生物學(xué)特性，并證實(shí)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠客觀評(píng)價(jià)體內(nèi)深部腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移情況，為進(jìn)一步研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of Orthotopic Transplant Model of Human Lung Cancer and Observation of In vivo Biofluorescent Imaging in Nude Mice

LIU Qian， LIU Song， Han Feng-feng， GUO Xue-jun
（Department of Respiration Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Objective To establish orthotopic transplant models of human lung cancer and study the in vivo biological characteristics of human lung cancer with high and low metastatic potential cells in nude mice.Methods The low-metastatic human lung cancer cell line SPC-A-1 and high-metastatic human lung cancer cell line SPC-A-1sci were tranfected with green fluorescent protein/Luciferase （GFP/ Luc） gene by lentiviral vector， they were orthotopically transplanted into the lung of nude mice.The tumor growth and metastasis were observed by using in vivo biofluorescent imaging system and anatomical methods.Results The human lung cancer cell lines with stable high-level GFP/Luc expression and orthotopic transplant animal models were successfully established.In vivo biofluorescent images showed that the luciferase expression rates of SPC-A-1-GFP-Luc and SPC-A-1sci-GFP-Luc cells were 50.0% （12/24） and 62.5% （20/32）， respectively.The expression intensity and area of luciferase expression in SPC-A-1sci-GFP-Luc cells were higher than that in SPC-A-1-GFP-Luc cells.Anatomical examination showed that tumor formation rates of SPC-A-1 cells and SPC-A-1sci cells were 50.0% （12/24）and 62.5% （20/32）， respectively.Meanwhile， the spontaneous metastasis rate was 25.0% （3/12）and 40.0% （8/20） in vivo.Conclusions Lung orthotopic transplant animal model could reproduce the biological characteristics of tumor growth and metastasis.In vivo biofluorescent imaging system was suitable for the objective evaluation of the biological characteristics.

Human lung cancer； Orthotopic transplantation； In vivo imaging system； Lentiviral vector

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0250-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.002

2016-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81400026）

劉 乾（1980-）， 女， 主治醫(yī)師。

E-mail： liuqian_1980@hotmail.com

郭雪君（1964-）， 男， 醫(yī)學(xué)博士， 主任醫(yī)師， 研究方向：

呼吸系統(tǒng)疾病。E-mail： snowgen@126.com